上海大学转化医学研究院（Institution of Translational Medicine, SHU）的团队2023年4月5日在SCIENCE ADVANCES上发表了题为Maintaining hypoxia environment of subchondral bone alleviates osteoarthritis progression的研究型论文，揭示了OA早期软骨下骨过度激活的破骨细胞促进H型血管生成，引起关节氧微环境改变，是OA发生进展的关键环节，维持软骨下骨低氧微环境可有效延缓OA进展。
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背 景
骨关节炎(Osteoarthritis, OA)是一种影响整个关节的复杂疾病，以软骨退行性变、骨重塑异常、骨赘形成和关节炎症为特征。OA是导致残疾和疼痛的主要原因，全球有超过3亿人受到影响。目前的治疗方法有环氧化酶-2抑制剂，主要帮助缓解症状。由于对OA发病机制的了解有限，目前尚无改善OA病情的药物。
软骨下骨破骨细胞过度活化与OA进展密切相关。在生理上，软骨下骨的骨重塑活性和破骨细胞数量受到严格控制，在OA小鼠模型早期破骨细胞数量明显增加。关于破骨细胞在OA中的作用，已有几种假说。破骨细胞前体迁移到软骨层，直接与肥大的软骨细胞接触，降解骨软骨连接处和关节软骨。通过破骨细胞骨吸收从骨基质中释放的生长因子包括转化生长因子β 1、胰岛素样生长因子1和血小板衍生生长因子BB (PDGF-BB)调节软骨细胞代谢。OA模型破骨细胞数量在达到峰值后明显下降，但软骨退变持续恶化。因此，破骨细胞在软骨下骨和软骨细胞之间的串扰中的作用仍然是一个谜。
在这篇研究中，作者采用先前报道的Lcp1敲除小鼠破骨细胞形成受损，并建立了前交叉韧带横断(ACLT) OA模型。ACLT后Lcp1−/−小鼠显示关节软骨保留和OA进展延迟。在机制上，破骨细胞激活的血管生成提高了软骨下骨和软骨的氧浓度。氧分压升高破坏关节缺氧环境，通过破坏缺氧诱导因子1α亚基(HIF-1α)功能促进软骨细胞变性，而稳定HIF-1α功能可防止软骨破坏。
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结 果
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软骨下骨中活蛋白上调与早期OA中破骨细胞活性增加相关
为了探讨破骨细胞和淋巴细胞胞浆蛋白(LPL)在骨关节炎（OA）的作用，作者分析了野生型(WT)小鼠前交叉韧带切断（ACLT）后不同时间点的微计算机断层扫描(micro-CT)和膝关节切片。软骨退变在8周内持续进展。在骨性关节炎的发展过程中，透明软骨(HC)的厚度减少，而钙化软骨的厚度成倍减少(CC)，在8周时HC/CC的比值下降到平均0.81。软骨下骨量在ACLT术后2周下降，骨量/总积(BV/TV)为34.3 ~ 55.8%术后4、8周BV/TV分别为56.6% ~ 76.2%(图1、C、D)。全关节微CT三维重建图像显示，ACLT术后8周形成较大骨赘(图S1、C、D)。软骨下骨板厚度(SBP.th)、骨小梁间距(Tb.sp)、骨小梁模式因子(Tb.pf)的变化与此趋势一致(图1F)。相应的，抗酒石酸酸性磷酸酶阳性(TRAP+)细胞在ACLT后的前2周内迅速增加，达到平均13.4个细胞/mm2的峰值，2周后下降(图1、E和G)。而ACLT后2周，LPL+和TRAP+细胞数量明显增加，提示早期OA软骨下骨的骨重塑加速。
图1.软骨下骨l -活蛋白上调与OA早期破骨细胞活性升高相关
02
敲除Lcp1可减少软骨下骨吸收，改善关节软骨退变
为了探索LPL在OA进展中的作用，作者通过删除Lcp1的外显子4来生成Lcp1−/−小鼠。虽然Lcp1突变片段可以表达，但根据之前的研究，突变蛋白不具有正常的功能。Micro-CT结果显示，Lcp1基因敲除小鼠软骨下骨的BV/TV在2周和4周时平均分别增加到75.1和81.9%，而同窝小鼠的BV/TV平均分别为55.8和67.4%ACLT(图2、A、B)。之前的研究表明，Lcp1基因敲除小鼠软骨下骨中TRAP+细胞的数量几乎是前者的一半(53.7和54.2%)， WT组在ACLT后2周和4周(图2、D和E)。与WT小鼠相比，Lcp1敲除减少了1.25倍和2.25倍(图2,F和G)。HC/CC的比值在Lcp1基因敲除小鼠4周和8周后显示为1.42倍和1.71倍。在ACLT后2周，WT小鼠神经导向因子-1（NETRIN-1）水平升高。综上所述，Lcp1基因敲除可缓解以软骨下骨吸收迟缓为特征的OA进展，减轻关节软骨退变，改善疼痛。
图2.Lcp1基因敲除小鼠软骨下骨吸收和关节软骨退行性变减慢
03
Lcp1敲除会损害血管生成并维持软骨下骨和软骨的低pO2
在生理状态下，由于缺乏血管，软骨内的氧浓度被严格维持在很低的水平，缺氧对软骨细胞的生存和体内平衡至关重要。破骨细胞介导h型血管的形成，为ACLT后软骨下骨提供丰富的氧气。作者假设Lcp1敲除抑制破骨细胞诱导的血管生成，并阻断氧气从软骨下骨向软骨的扩散。为了验证这一假设，作者首先对软骨下骨进行了微血管摄影，结果显示，在小鼠软骨下骨，ACLT后4周和8周血管体积增加了1.56倍和1.62倍。相比之下，ACLT后Lcp1−/−小鼠的血管体积没有明显变化(与假手术组相比，分别为0.95和1.14倍)(图3,A和B)。接下来，评估CD31hiEMCNhi血管的水平。与血管体积水平一致，在ACLT后4周和8周，WT小鼠中CD31和内皮粘蛋白（EMCN）阳性细胞的数量显著增加，平均为20.4和23.1个细胞/mm2，而在ACLT后Lcp1缺失中，平均增加到12.9和15.2个细胞/mm2(图3,C和D)。总之，Lcp1敲除会阻碍h型血管的形成，并维持软骨下骨和软骨的缺氧环境。
图3.Lcp1敲除会损害血管生成并维持软骨下骨和软骨的低pO2
04
在人和小鼠OA软骨中观察到HIF-1α的缺失
为了探讨pO2影响软骨退变的机制，作者假设氧浓度通过HIF-1α影响软骨细胞，HIF-1α是一种由氧调节软骨细胞稳态的重要转录因子。首先，作者发现HIF-ACLT后WT小鼠HIF-1α水平下降，敲除Lcp1可缓解这种下降。在ACLT后4周和8周，Lcp1基因敲除小鼠的HIF-1α阳性面积分别是WT小鼠的1.26倍和1.36倍(图4,A和B)。为了进一步证实HIF-1α的表达，作者从患者身上收集了不同OARSI等级的人关节软骨(图4C)。HIF-1α在S0软骨浅层和深层富集(分别为80.6%和75.5%);然而，当骨性关节炎进展时，水平显著下降(图4、D、E)。S2 ~ S4期软骨组织中几乎没有HIF-1α的表达。综上所述，软骨变性伴随着缺氧环境的破坏和软骨细胞中HIF-1α的降解。
图4.在人和小鼠OA软骨中观察到HIF-1α的缺失
05
敲除关节软骨中的Hif1a部分消除Lcp1敲除的保护作用
接下来，作者探索Lcp1敲除是否通过抑制HIF-1α降解来缓解OA进展。作者首先证实关节内注射携带腺相关病毒(AAV)Hif1a敲低RNA (shRNA)能够在WT和Lcp1小鼠中敲低Hif1a，敲低率为86.7 ~89.8%(图5,A和B)。Lcp1敲除小鼠的h型血管形成不受软骨中Hif1a敲除的影响(图5,C和D)。在阴性对照(NC)组，与Lcp1小鼠相比，在ACLT后4周和8周，WT小鼠的OARSI等级显著提高了4.6倍和1.91倍。HC/CC比值降低在ACLT后4周和8周，NC AAV WT小鼠与Lcp1-/-小鼠相比，前者为1.2倍和1.6倍，但Hif1a敲除后两组间无显著差异。这些结果表明，软骨中Hif1a的敲低不影响软骨下骨的变化。
图5.敲除关节软骨中的Hif1a可部分消除Lcp1敲除的保护作用
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讨 论
在本研究中，作者团队采用先前报道的Lcp1敲除小鼠，其特征是破骨细胞形成受损，并建立了前交叉韧带横断(ACLT)OA模型。Lcp1敲除小鼠在ACLT后显示关节软骨保留和OA进展延迟。在机制上，破骨细胞激活的血管生成提高了软骨下骨和软骨的氧浓度。氧分压升高破坏关节缺氧环境，通过破坏缺氧诱导因子1a亚基(HIF-1a)功能促进软骨细胞变性，而稳定HIF-1a功能可防止软骨破坏。
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