2024年8月9日，南京医科大学李相成及李长贤共同通讯在Advanced Science 在线发表题为“CircUGP2 Suppresses Intrahepatic Cholangiocarcinoma Progression via p53 Signaling Through Interacting With PURB to Regulate ADGRB1 Transcription and Sponging miR-3191-5p”的研究论文。该文章确定了circUGP2通过调控ADGRB1/p53轴在ICC中作为肿瘤抑制因子的作用，而脂质纳米颗粒的应用为ICC治疗提供了一种有希望的转化策略。
肝内胆管癌（ICC）是肝脏第二常见的原发性恶性肿瘤，其发病率和病死率均呈逐年上升趋势。由于生物学特性与肝细胞癌和肝外胆管癌存在显著差异，不仅缺乏特征性临床症状和肿瘤标志物，且侵袭性强，手术切除率低，术后易复发转移，致使总体预后极差。ICC患者中仅有20%-30%的患者可以接受潜在治愈的手术切除治疗，据文献报道，手术切除的患者使用卡培他滨辅助治疗，中位总生存期为53个月。对于70%–80%局部不可切除或远处转移性ICC的患者，系统治疗可能会延缓疾病进展，但生存期仍限于大约1年。因此，迫切需要深入研究ICC的分子机制并开发新的治疗策略以提高患者的生存率。
环状RNA（circRNA）是由pre-mRNA的反向剪接产生的，内含子下游5'剪接位点与上游3'剪接位点连接，形成一个封闭的连续的头对尾分子，称为环状RNA（circRNA）。由此产生的分子没有末端5 'cap和3 'polyA尾巴，外切酶不易接近，因此比线性RNA更稳定。circ-RNA具有多种生物学功能，如作为转录调控因子，通过单独或与RNA结合蛋白（RBP）互作，发挥转录调控作用；充当miRNA海绵特异性吸附miRNA，从而影响miRNA对靶mRNA的负调控；甚至还可作为蛋白翻译模板，在肿瘤的发展过程发挥重要作用。研究发现在ICC等多种癌症类型中，circRNAs的表达出现了失调，这表明它们在肿瘤的发生和发展中扮演着重要角色。然而，circRNA在ICC中的发病机制中的潜在机制仍不清楚，在肿瘤部位精确干扰circRNA目前仍然是一个挑战。因此，本文以HCC为疾病背景，对与其高度相关的circRNA进行展开研究。
作者首先利用3组ICC和正常组织进行circRNA-seq分析，找到ICC中下调显著的circRNA—hsa_circ_0001020 (circUGP2)。GEO数据库也进一步验证了circUGP2在ICC中表达下调。通过对ICC患者数据进行分析，发现circUGP2低表达与不良预后以及晚期TNM分期之间存在显著相关性。随后通过RT-qPCR和RNA稳定性实验，发现circUGP2能够在ICC细胞中成环且较线性UGP2更稳定。核质分离实验和荧光原位杂交（FISH）实验显示circUGP2在细胞核和细胞质中均存在。
为了验证circUGP2对ICC细胞功能的影响，作者对ICC细胞系分别进行了敲低和过表达circUGP2处理。随后的CCK-8和克隆形成实验表明circUGP2 敲低促进了增殖，而circUGP2过表达抑制了增殖。Transwell和划痕实验证明，敲低circUGP2可以增强ICC细胞迁移和侵袭能力，而过表达circUGP2则发挥相反的功能。为了进一步在体内对circUGP2进行研究，作者分别将circUGP2过表达和敲低ICC细胞株皮下注射到裸鼠体内。结果显示circUGP2过表达显著抑制肿瘤生长，而circUGP2敲低则促进了肿瘤生长。此外，作者还建立了肝转移模型。结果表明，circUGP2过表达可减少肝转移性结节的数量，而敲低后结果完全相反。
3、circUGP2通过激活p53信号通路抑制ICC进展
为了阐明circUGP2抑制ICC进展的分子机制，作者利用RNA-seq联合KEGG通路分析，发现circUGP2过表达后p53信号通路被激活。RT-qPCR和western blot实验证明p53信号通路因circUGP2过表达而激活，因circUGP2敲低而抑制。随后，作者分别用p53蛋白抑制剂Pifithrin-α (PFTα)和p53-MDM2复合物拮抗剂Idasanutlin处理ICC细胞以模拟抑制/激活p53通路，通过克隆形成和transwell实验发现，Idasanutlin可逆转circUGP2敲低的不利影响，而PFTα可消除circUGP2过表达抑制ICC进展的作用。
为了深入研究circUGP2在p53信号通路中的调控作用，作者以circUGP2蛋白为探针，通过蛋白质谱联合ICC患者预后分析，筛选到互作蛋白PURB。RNA pull down和RIP实验也证实了这一结果。此外，克隆形成和transwell实验显示PURB 过表达可抑制ICC进展并能够逆转circUGP2敲低的有害影响。为了进一步明确互作位点，设计了不同截短体的PURB并进行RNA pull down实验，结果证明PURB的第三个PUR重复序列是二者的互作结合域。IF-FISH实验也表明circUGP2和 PURB在ICC细胞核中共定位。
5、CircUGP2作为PURB的转录共激活因子，促进ADGRB1表达
由于PURB可作为转录激活因子或抑制因子发挥作用，作者首先利用抗PURB抗体在RBE细胞中进行了CUT&RUN测序，随后联合RNA-seq和KEGG数据库中的p53信号通路相关基因绘制韦恩图，筛选到circUGP2和PURB下游靶标ADGRB1。CUT&RUN-qPCR和双荧光素酶报告基因实验证实circUGP2和PURB均结合在ADGRB1启动子转录起始位点（TSS）的-2000至-1600 bp区域，并促进ADGRB1转录。
6、CircUGP2通过海绵吸附miR-3191-5p上调ADGRB1表达
由于circRNA在细胞质中倾向于充当miRNA海绵，且前期实验也发现ICC细胞的细胞质中也存在circUGP2，于是作者假设circUGP2也可以在ICC中发挥海绵吸附的作用。通过多平台的miRNA 靶标预测，确定了4个候选miRNA。随后通过circUGP2标记的RNA pull down实验和RIP实验，最终筛选到了microRNA—miR-3191-5p。患者预后分析显示miR-3191-5p水平降低与生存率提高有关。随后，作者通过CCK-8等表型实验证明了miR-3191-5p在ICC中发挥促癌作用，且这些作用会被circUGP2过表达或敲低所影响。同时，作者发现在ICC患者中ADGRB1表达与miR-3191-5p呈负相关，western blot实验也显示ADGRB1和 p53蛋白水平被miR-3191-5p模拟物下调，而被miR3191-5p抑制剂上调。随后，通过双荧光素酶报告基因实验，证明了miR-3191-5p能够与circUGP2和ADGRB1 3′-UTR区结合抑制ADGRB1转录。
7、CircUGP2 激活ADGRB1/p53轴以抑制 ICC 进展
因为在髓母细胞瘤中ADGRB1被证明可阻止MDM2介导的p53多泛素化，于是作者首先在ICC细胞中进行了共免疫沉淀（Co-IP）实验，结果表明ADGRB1 siRNA促进了MDM2介导的p53多泛素化，而circUGP2过表达可抵消这种影响。CCK-8等表型实验也表明在ICC细胞中circUGP2过表达的抑制作用可以通过ADGRB1敲低来抵消。
8、利用LNP包裹的circUGP2质粒的治疗策略显示出抗肿瘤作用
由于脂质纳米颗粒（LNP）递送策略是一项革命性的治疗发展，能够递送 siRNA、mRNA、DNA 和小分子药物，且FOLR1（叶酸受体）在RBE（ICC）细胞中过表达，于是作者利用叶酸偶联且用DiD标记的LNP递送系统包裹circUGP2质粒，通过尾静脉注射到RBE细胞造模的皮下荷瘤小鼠体内。随后，通过荧光成像发现荧光信号在肿瘤部位积累，且持续至少24小时。然后作者又利用稳定敲低circUGP2的RBE细胞建立了皮下肿瘤异种移植模型，并给予LNP-circUGP2治疗。结果表明，LNP-circUGP2治疗上调了皮下肿瘤中的circUGP2水平并激活了p53信号通路，最终抑制了肿瘤生长。此外，在肝转移模型中LNP-circUGP2治疗也减少了肝转移结节的数量，显现出较高的治疗价值。
1、首次阐明了circUGP2在ICC发生发展中的分子机制；
2、证明了LNP-circUGP2能够特异性靶向ICC细胞发挥抗肿瘤作用，为 ICC 治疗提供了一种有前途的转化策略。
1、未考虑将LNP-circUGP2治疗与ICC临床治疗药物卡培他滨治疗进行联用，以拓宽LNP治疗途径。
1、跳出常规思维，确立circRNA为研究对象，利用细胞/组织进行circRNA-seq分析缩小筛选范围。通过患者预后分析、成环实验以及RNA稳定性实验，最终锁定研究对象；
2、通过亚细胞定位表征研究对象的功能，进行疾病相关表型验证；
3、通过RNA-seq和KEGG通路分析筛选研究的circRNA分子可能参与的信号通路。基于亚细胞定位，若侧重点是circRNA-蛋白互作则进行质谱分析和RNA pull down实验验证，寻找靶基因；若侧重点是海绵吸附功能，则通过多平台miRNA 靶标预测，确定候选miRNA。随后通过文献调研及患者表达量相关性分析确定miRNA靶基因，以双荧光素酶报告基因实验进行佐证；
4、利用脂质纳米颗粒递送系统良好生物相容性和体内递送能力，设计治疗方案，实现精确靶向治疗。
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