xMAP 实验策略及优化：微球偶联是怎么发生的

xMAP^® 微球作为载体，可在其表面偶联核酸或是蛋白，用于不同的检测及应用，但是偶联是怎么连接？偶联实验需要注意哪些地方？有没有什么秘密招式可以快速完成偶联实验呢？

今天就来聊聊微球偶联是怎么发生的！ 

xMAP^® 微球可以作为载体，全靠表面上满满的羧基。无论是带磁性或是不带磁性，微球表面均有超过一亿个以上的羧基（COOH）覆盖于其上，用以与具有氨基（NH3）基团的捕获配体，通过碳二亚胺反应，进行共价连接。

微球表面具有 COOH 官能基^[1]

《蛋白应用》

蛋白偶联化学^[2]

《核酸应用》

进行核酸检测应用，需要将寡核苷酸偶联到微球上。

寡核苷酸偶联是一个一步过程，在此过程中，微球羧基基团被 EDC 激活并与带胺基修饰的寡核苷酸伯胺形成共价键。

核酸偶联化学^[2]

偶联在微球上的捕获分子，需要在环境好气氛佳的情况下，与样本中的检测标的结合，达到检测目的。不同的实验方法，需要的反应条件各不相同，而合适的反应条件除了涉及温度、孵育时间、缓冲液成分等因素，空间也很重要。

若分子量 <10 kDa （如肽及寡核苷酸等小分子），为了避免因为空间位阻降低反应效率，偶联反应中必须加上 spacer 的修饰，以确保得到良好的检测结果。

• 蛋白 linker 
  例如：白蛋白、血蓝蛋白、甲状球蛋白、亲和素
• 小分子 linker
  例如：乙二酸二酰肼（ADH）、马来酰亚胺酰肼（MPBH）、镍-次氮基三乙酸（Ni-NTA）
• C6-18 碳桥肩臂（6-18 carbon spacer）
  

一旦偶联完成之后，建议在开始实验检测前，对微球进行偶联效率评估。

在偶联的实验中，建议使用不同配比的微球与捕获分子，以得到提供最强信号的最佳偶联反应比例。

偶联验证的检测讯号强度，随加入抗体（左）/互补序列（右）浓度而增加^[2]

经过偶联验证后的微球，才正式进到实验的第一步（┗|｀O′|┛ 嗷~前面这些都是实验开始前的准备工作），想找偷懒更高效的方法吗？那肯定就是 MagPlex-TAG™ 微球啦！

MagPlex-TAG™ 微球又被昵称为标签微球，适用于核酸检测，共有 150 种编号的微球，每种编号微球上各偶联专有的序列。这 150 种寡核苷酸，都是带有氨基以及碳桥的修饰，且经过特别优化的序列，只使用 T/A/G （不含 C），组成长度为 24 个碱基的序列，这也是 ”标签“ 微球昵称的由来。

使用 MagPlex-TAG™ 微球时，只需要在实验设计时，在引物前端加上与特定微球片段互补的序列；在 PCR 的过程中，一旦有目标片段存在，带互补序列的引物即可藉由扩增或是延伸的方式，以目标片段为模板，得到能够与微球连接并具有标记的产物，被 Luminex 仪器识别。