如何做出好的标准线

俗话说得好 : 好的开始是成功的一半，那么对于定量实验来说，好的开始应该就是拥有一条好的标准曲线。那么该如何制作出一条好的标准曲线呢? 今天就来跟大家讨论标准线

在 xMAP^® 的平台上进行定量实验时，需要提前准备好不同浓度的标准品，再根据实验测定所获取的荧光数值，绘制出标准线。

选用标准品时需要注意以下事项^[1]：

• 浓度范围

为使建立的标准曲线能够有效覆盖实验样本的浓度，在设置标准品浓度范围时最好可以有比较大的跨度，确保未知样品的浓度可以落在标准品上下限浓度之间。

• 数量

标准品的数量至少应有三个浓度，每个标准点至少重复两次。增加标准品数据点数量，可以使标准线更具代表性。

• 组分

标准品的组分尽量与被测样品组分一致，使用相同的缓冲液进行稀释。

曲线拟合的目的是要找寻最合适的公式与参数，以匹配获取的数据，绘制出一条平滑的曲线，尽可能通过每一个数据点。

标准曲线的拟合方式甚多，包括线性回归及非线性回归，不同的实验数据适合的拟合方式各不相同，其中常见的拟合方式有四参数和五参数非线性回归法。使用至少六个不同浓度的标准品时，无论以何种拟合公式，均可得到较准确的计算结果^[2]。

• 线性回归

线性回归是最简单，也是最基本的曲线回归法，将所有的数据点拟合为一直线，其拟合方程式为：y= ax+b。

线性回归需要最少三个浓度的标准品数据，越多标准品数据点可增加拟合的准确性，线性回归的优点是公式计算简单，缺点则是大多数标准品的数据，呈现的是 "S" 型非线性关系，所以并不符合实验应用状况（如下图所示）。

相同的数据点，不同公式拟合效果不同

• 非线性回归

非线性拟合的方式包括 cubic spline、四参数拟合 (4PL)、五参数拟合(5PL) 等，其中四参数拟合与五参数拟合是最常见的，这两种非线性曲线拟合均适用于 "S" 型曲线的回归分析，建议使用六个以上的数据点以获取更准确的拟合公式。

四参数拟合曲线 (4PL)

四参数拟合为含有四个参数的方程式，是一个对称的曲线，假设曲线的两侧以中心拐点完全对称。

五参数拟合（5PL）

多数生物实验的数据不是四参数拟合的完全对称，而五参数拟合考虑了不对称的情况，通常更适合免疫分析使用。与四参数拟合公式相比，因为多加入了一个新的参数，可以更好的贴合实际数据。

左：四参数拟合公式；右：五参数拟合公式

“喏~~做出一条 0.999 的标准曲线，是不是就可以每次只上样本，都拿它来计算未知样本浓度？行不行呢？数据准确不准确呢？”

在实验过程中，每次操作时的条件都可能发生变化（标准品、操作人员、仪器等），当标准品与未知样本于相同条件状态下一起操作时，绘制出的标准线，才最能准确反应出实际检测状态及检测结果。

在 xPONENT 软件中提前设置定量检测实验，当数据读取完成后，软件即可马上根据标准品获取的荧光值，绘制出标准曲线，同时根据未知样本获取的荧光值计算浓度。