干货分享|3个耳聋相关基因的功能证据使用解析

        功能实验是一种研究变异致病性的非常强大的工具, 然而并非所有的功能实验都能有效地预测突变对蛋白功能的影响。当需要评估一个实验结果是否有效时, 必须考虑该实验在多大程度上反映了蛋白发挥功能的生物环境^[1]。例如, 与体外进行的蛋白表达实验相比，在动物模型上进行的功能实验会更具有说服力。然而，大多数与听力障碍相关的基因缺乏完善的功能实验，以致很多时候无法提供充足的证据用以有效评估变异致病性^[2]。

        为了更大限度地利用已有的功能实验证据，优化耳聋相关变异的致病性评估，ClinGen听力损失专家组在2018年发表了耳聋专项指南，对功能研究证据做了进一步的调整和细分。

        与2015年ACMG指南相比，2018年的耳聋专项指南根据功能实验的性能不同，将证据分为了强度不同的3个层次，如下表所示：

        在2018年耳聋专项指南中，专家组特别列举了耳聋3个常见基因可应用的且被充分验证的功能研究方法，并对功能证据的使用做了详细的说明。

编码蛋白：connexin 26，间隙连接蛋白26

可应用的功能实验：电耦联实验和荧光染料扩散实验

        间隙连接蛋白形成两个相邻细胞之间的间隙连接通道，在内耳柯蒂氏器的支持细胞、螺旋缘等结构中均有表达，主要负责在细胞间输送离子、营养物质、信号分子等物质。

        目前大多数关于GJB2的功能研究主要使用非洲爪蟾卵母细胞或哺乳动物细胞系来进行。研究人员首先会使用突变体和野生型表达载体转染细胞，然后通过电耦合或荧光染料扩散实验来测定变异对其功能的影响。

        在电耦联测定中，当改变一个细胞中的电压时，利用膜片钳或离子注射和染料螯合等方法可以测量相邻细胞中的电流变化，通过与对照组比较，实现对变异connexin26蛋白功能的测定。如图1^[3]所示：

图1 （A）野生型蛋白在传导电压(Vj)为 −95 mV (V1=−5 mV; V2=−100 mV; n=4)时的电导变化(gj)和相应的电流跃迁(Ij)。由此计算所得的细胞单通道传导性(γ)为114 pS。 （B）M34T突变体在持续电压 Vj=−100 mV (V1=0 mV; V2=−100 mV; n=2)的条件下的电导变化(gj)和相应的电流跃迁(Ij)。由此计算所得的细胞单通道传导性(γ)约为13pS。

        我们可以清晰的发现M34T突变体的电流变化与野生型明显不同，故可判断M34T变异会对蛋白功能产生影响。

        在染料扩散测定中，荧光染料在相邻细胞之间的移动将被量化为连接蛋26功能的强弱。通过比较变异体和野生对照组间的差异，可判定变异蛋白的功能情况。如图2^[4]所示，在野生型GJB2基因转染的细胞中观察到GFP阳性细胞之间的荧光黄转移，但在I33T、E120del和W172R突变中未观察到这种染料转移，故推测这三种突变损害蛋白功能。

图2 左列显示注射前的GFP阳性细胞（指示表达外源连接蛋白26），右列显示注射5分钟后的黄色荧光分布。 星号标注了显微注射的细胞。

        一般来说，破坏连接蛋白26功能的变异中，可见电耦联和染料转移显著下降。鉴于两种测定均显示出高灵敏度和阳性预测值，专家组建议将PS3_Moderate用于功能实验中有显著结果的GJB2变异。

表2 GJB2 基因功能实验致病评级标准

编码蛋白：Pendrin，一种阴离子转运蛋白

可应用的功能实验：放射性同位素和荧光测定实验

        Pendrin是阴离子转运蛋白家族SLC26的成员，其介导阴离子的交换，包括Cl^-，HCO3^-，OH^-，I^-和甲酸。在内耳中，pendrin能介导Cl^-/ HCO3^-交换，从而参与内淋巴液的调节，pendrin的功能障碍是导致Pendred综合征 (PS) 和非综合征DFNB4耳聋伴有前庭水管扩大 (EVA) 的主要原因。

        放射性同位素[14C]标记的甲酸盐可被用来测定Pendrin蛋白的转运活性。 如图3^[5]所示，与正常的pendrin相比，所有突变体pendrins显示出显著降低的转运功能 (P <0.01)。

图3 通过同位素测定的多种突变体与野生型Pendrin蛋白的转运活性

        由于pendrin可以转运碘化物 (I^-)，而碘化物是一种eYFP 荧光猝灭剂，因此，细胞内碘化物的增加应导致eYFP荧光的减少。如图4^[6]所示，向细胞外溶液中加入碘化物导致表达野生型pendrin的细胞中eYFP荧光显着降低，而突变体P70L，P301L和F667C的细胞内荧光仅发生微小变化，提示相应的突变体发生了功能丧失。

图4 通过荧光猝灭法测定的多种突变体与野生型Pendrin蛋白的转运活性

        需要注意的是，与前面介绍的GJB2 的功能实验相比，同位素测定和荧光染料测定这两种实验具有较低的阳性预测值，所以，当两种方法分别提示致病或良性效应时，专家组推荐使用PS3_Supporting或BS3_Supporting。

表3 SLC26A4 基因功能实验致病评级标准

编码蛋白：cohlin，一种分泌蛋白

可应用的功能实验：免疫荧光和蛋白质印迹技术 (Western Blotting)

        COCH是常染色体显性遗传性耳聋的主要致病基因。免疫荧光和Western Blotting可用于测定细胞中cochlin蛋白的分泌，定位和翻译后修饰。与野生型cochlin相比，蛋白功能异常的模式包括不存在细胞外沉积 (即没有分泌)，细胞内聚集 (即在内质网和高尔基体中)，以及形成异常的二硫键，干扰蛋白质分泌。

        通过免疫荧光实验可见野生型cochlins蛋白与ER和高尔基体复合物标记物共定位，但突变体不与高尔基体共定位，如图5^[7]提示突变的cochlins蛋白从ER到高尔基体的运输不足。

图5 免疫荧光结果图

        该研究同时对转染细胞的细胞裂解物和培养基进行了Western Blotting。如图6左图所示，转染了野生型和所有突变体表达载体的细胞均表达cochlins蛋白。 但在转染细胞的培养基中，仅检测到野生型和三种突变体的cochlin条带，而其他五种突变体未被检出，表明这些cochlins的分泌不足。

图6 Western Blotting结果图。上图显示突变体和野生型表达载体均成功转染和表达。下图显示p.V104del, p.I109T, p.F121S, p.C162Y, p.A487P没有分泌。

        基于这两种测定方法的高灵敏度和阳性预测值, 如果变异蛋白与野生型蛋白相比表现出异常分泌，二聚化或定位模式，专家组建议使用PS3_Moderate。但因为使用这类实验测试的良性突变较少，如果在这类功能实验中突变蛋白显示出与野生型一样的结果则用BS3_Supporting。如果多个实验结果不一致，则不应使用任何标准。

参考文献：

1. Richards S , Aziz N , Bale S , et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genetics in Medicine, 2015, 17(5):405-423.

2. Oza A M , Distefano M T , Hemphill S E , et al. Expert specification of the ACMG/AMP variant interpretation guidelines for genetic hearing loss. Human Mutation, 2018, 39(11):1593-1613.

3. Bicego, M., Beltramello, M., Melchionda, S., Carella, M., Piazza, V., & Zelante, L. (2006). Pathogenetic role of the deafness-related M34T mutation of Cx26. Human Molecular Genetics, 15(17), 2569–2587. https://doi.org/10.1093/hmg/ddl184

4. Mani, R. S., Ganapathy, A., Jalvi, R., Srikumari Srisailapathy, C. R., Malho- tra, V., & Chadha, S. (2009). Functional consequences of novel connexin 26 mutations associated with hereditary hearing loss. Euro- pean Journal of Human Genetics, 17(4), 502–509. https://doi.org/ 10.1038/ejhg.2008.179

5. Yuan, Y., Huang, D., Yu, F., Zhu, X., Kang, D., & Yuan, H. (2009). A de novo GJB2 (connexin 26) mutation, R75W, in a Chinese pedigree with hearing loss and palmoplantar keratoderma. American Journal of Medical Genetics Part A, 149A(4), 689–692. https://doi.org/10.1002/ajmg.a.32461

6. Dossena, S., Bizhanova, A., Nofziger, C., Bernardinelli, E., Ramsauer, J., & Kopp, P. (2011). Identification of allelic variants of pendrin (SLC26A4) with loss and gain of function. Cellular Physiology and Biochemistry, 28(3), 467–476. https://doi.org/10.1159/000335108

7. Bae, S. H., Robertson, N. G., Cho, H. J., Morton, C. C., Jung, D. J., & Baek, J. I. (2014). Identification of pathogenic mechanisms of COCH mutations, abolished cochlin secretion, and intracellular aggre- gate formation: Genotype-phenotype correlations in DFNA9 deaf- ness and vestibular disorder. Human Mutation, 35(12), 1506–1513. https://doi.org/10.1002/humu.22701