癫痫（Epilepsy），俗称“羊角风”，是一种由多种病因引起的慢性脑部疾病，具有较强遗传倾向的复杂症状。国际抗癫痫联盟(ILAE)将癫痫分为癫痫发作类型、癫痫类型和癫痫综合征[1]，活动性癫痫的发病率为4~12‰。癫痫在任何年龄、地区和种族的人群中都有发病，但以1岁以下婴儿和50岁以上人群为主。目前，癫痫发病原因主要为遗传、结构、代谢、传染性、免疫和未知六大类。为了进一步探究癫痫发病机理，由安吉康尔和郑州大学第一附属医院儿科罗强主任、董伟医生（第一作者）共同研究，采用全外显子测序技术（WES）检出一例癫痫患儿的RORB基因突变，并利用诱导多能干细胞技术将患儿的外周血细胞重新编程诱导为多能干细胞状态，为研究RORB基因及其相关疾病建立了人源细胞模型。(全文见：DOI: 10.1016/j.scr.2021.102177)
本研究基于诱导多能干细胞（iPSCs，induced Pluripotent Stem Cells）技术，通过导入特定的转录因子将终末分化的体细胞重编程为多能干细胞，可运用于构建疾病细胞模型（如3D organoids）和研究疾病致病机理等。实验过程为从携带RORB基因突变的患者外周血分离培养外周血单核细胞（PBMC，peripheral blood mononuclear cell），通过病毒载体，将转录因子OCT3/4、SOX2、KLF4和 c-MYC转染到PBMCs，采用非整合重编程技术构建ZZUNEUi019-A iPSCs。通过免疫荧光染色检测、体外拟胚体形成及三胚层分化能力检测鉴定特异性iPSCs的多能性，通过核型分析、STR（短串联重复序列）分析鉴定ZZUNEUi019-A iPSCs[2]。
患者为5岁女孩，伴有轻度精神发育迟缓、癫痫、脑电图异常。患者符合癫痫表型，采用安吉康尔全外显子测序产品（WE-SeqcareTM）检测患者及其父母，检出患者携带有RORB基因杂合突变(NM_006914.3:c.94-1G>A, Intron 2/9；chr9: 77249546)[3]，其父亲为携带者（mosaic carrier）。RORB基因与特发性全身性癫痫易感性-15（epilepsy-15 ，EIG15）相关，为常染色体显性遗传、具有不完全外显特性。该基因突变位点在genomAD、ClinVar和HGMD均未报道过，随后采用iPSCs技术进行验证，基于患者PBMC建立ZZUNEUi019-A iPSCs，采用CytoTune 2.0 Sendai 重编程试剂盒和转录因子OCT3/4、SOX2、KLF4和 c-MYC转染PBMCs，结合免疫荧光染色检测、STR（短串联重复序列）分析等多种技术鉴定ZZUNEUi019-A iPSCs。原文发表于Stem Cell Research，IF=4.489。
Figure 1 WES测序结果图谱（右图为患者基因图谱，左图为iPSCs基因图谱）
采用iPSC技术对患儿外周血细胞进行重编程诱导，从而建立带有RORB基因突变的人源多能干细胞系，该突变（NM_006914.3：c.94-1G>A，Intron2/9）在iPSCs和患者PBMCs中均得到证实。ZZUNEUi019-A iPSCs显示为二倍体46，XX核型（Figure 2B）；流式细胞术鉴定到阳性干细胞标记物NANOG、SSEA4和OCT4（Figure 2FGH）；对三胚层分化能力标记Marker（AFP、Pax6、Brachyury）通过荧光显微镜进行评估（Figure 2IJH）。短串联重复 (short tandem repeat，STR) 分析提示ZZUNEUi019-A iPSCs为患者特异性，支原体检测ZZUNEUi019-AiPSCs显示无支原体。
Figure 2 iPS细胞系ZZUNEUi019-A基因型和表型鉴定
安吉康尔全外显子组测序技术检出一例RORB基因突变(NM_006914.3:c.94-1G>A, Intron 2/9；chr9: 77249546)的患者，该基因的变异与特发性全身性癫痫易感性-15（epilepsy-15 ，EIG15）相关，该突变进一步在iPSCs和患者PBMCs中得到证实。当前，很少有报道过RORB基因突变，本研究利用iPSC技术建立RORB基因突变患儿的多能诱导干细胞系，为RORB基因和对应疾病的致病机理研究提供了人源细胞资源。
Figure 3 特征和验证结果
安吉康尔WE-SeqcareTM全外显子测序产品4大特色：
WE-SeqcareTM全外显子测序是对受检者送检样本进行DNA提取，采用全外探针杂交捕获并构建文库，进行二代测序。目标区域覆盖度≥99.5%，覆盖22,000多个人类基因的外显子区域。拷贝数变异（CNV）采用独家开发的WEAVERTM算法进行分析。WEAVERTM算法可提高30%的CNV检出率（基因拷贝数变异可以通过序列覆盖度来进行检测，测序信号噪音来源广泛，需要使用基线样本进行降噪）。
WEAVERTM算法能通过比较先证者的序列覆盖深度和一个参照样本集合中测量出的基线深度分布，来计算每个外显子拷贝数的统计学可能性，能够极大提高染色体拷贝数变异的检出率。变异的致病性判读遵守ACMG指南，致病性证据会在报告中逐条列出，并采用Sanger测序技术对患者及其父母样本进行验证，二次复核变异真实性，明确变异来源。
