来自美国国立卫生研究院国家癌症研究所的Ryan M. Young教授团队在Nature Communication（IF=17.694）上发表了题为“Oncogenic RAS commandeers amino acid sensing machinery to aberrantly activate mTORC1 in multiple myeloma”的文章。该文章采用CRISPR、蛋白交互作用、质谱分析和磷酸化蛋白质组分析等技术，重新定义了多发性骨髓瘤中的RAS通路，并为靶向这种RAS信号传导模式提供了机制和合理的依据。
多发性骨髓瘤（MM）是第二常见的血液系统恶性肿瘤，随着蛋白质抑制剂和免疫调节药物的应用，这种疾病的治疗取得了实质性进展。然而，MM仍然无法治愈，大多数患者会复发并对现有治疗变得有耐药性。RAS（GTP酶）通路的突变在MM中很常见，并与对治疗的耐药性有关。尽管RAS突变的频率很高，大多数含有RAS突变的MM肿瘤没有检测到MEK（RAS的下游信号分子）活性，并且MEK抑制剂在临床治疗MM患者中仅取得了一定的成功。这些发现表明，RAS依赖的通路激活并不是恶性浆细胞中RAS信号的唯一模式，并指出RAS信号在该疾病中的作用尚未确定。
为了揭示MM中致病性RAS信号传导的机制，作者采用无偏倚的蛋白质基因组学方法，结合CRISPR-Cas9筛选来鉴定依赖KRAS或NRAS表达的MM系选择性必需基因，并且用定量质谱（MS）来确定MM细胞中突变RAS亚型的蛋白质相互作用伙伴。该方法揭示了突变体RAS的“基本相互作用组”，突出了RAS与SLC3A2（几种异二聚体氨基酸转运体的一个组成部分）之间的联系。
结果
1、MM的蛋白质基因组学筛查
作者在17个MM细胞系中进行了CRISPR-Cas9筛选，以鉴定恶性生长和存活所必需的基因（图1a）。作者比较了图1b中RAS依赖性MM系（分为KRAS依赖性和NRAS依赖性，x轴）与对KRAS或NRAS缺失不敏感的MM系（y轴）的CRISPR筛选结果。通过额外的平方和F检验，鉴定了在RAS依赖或RAS独立的MM系中选择性毒性更强的离群基因（图1b）。BioID2是一种混杂的生物素连接酶，可以在10-30 nm距离内对蛋白质进行生物素化。作者在RPMI 8226和XG2（骨髓瘤细胞系）中特异表达了BioID2融合KRASG12V，在SKMM1和L363 MM（骨髓瘤细胞系）细胞中特异表达了BioID2融合NRASG12V(图1c)。作者通过链亲和素下拉从这些细胞中纯化生物素化蛋白，并在细胞培养质谱（SILAC-MS）中使用氨基酸定量稳定同位素标记进行枚举（图1c），然后将BioID2-RAS相互作用组内蛋白质的富集程度与所有RAS依赖性MM细胞的CRISPR筛选数据平均值进行了比较（图1d），发现这些基本的相互作用不包括经典的RAS效应器，如BRAF。然后作者发现只有SLC3A2与KRAS和NRAS相互作用，并且在RAS依赖的MM系中更重要（图1e）。
图1 蛋白质基因组学筛查显示多发性骨髓瘤中SLC3A2和RAS之间的关系
2、SLC3A2调节RAS依赖性MM细胞中的mTORC1信号
作者通过免疫共沉淀技术证实SLC3A2与MM细胞中的RAS亚型相关（图2a）。然后，作者通过绘制BioID2-SLC3A2蛋白富集（y轴）与RPMI 8226 （x轴）中每个基因的CSS（CRISPR筛选评分）值（图2b）来确定SLC3A2基本相互作用组（图2b），发现在RPMI 8226细胞中KRAS和SLC3A2之间具有强相互作用。然后作者通过邻位连接技术（PLA）发现SLC3A2和RAS在两种细胞系中相互作用。敲低RAS异构体或SLC3A2可消除SLC3A2-RAS PLA信号，证明PLA检测这种相互作用具有特异性（图2d）。SLC3A2敲除显著降低了RPS6（mTORC1下游已知效应器p70S6K的靶标）多个丝氨酸残基的磷酸化（图2e）。此外，表达靶向SLC3A2、MTOR、RPTOR （mTORC1的一个组成部分）的sgRNAs和致癌RAS （RPMI 8226中的KRAS和SKMM1中的NRAS以粉红色显示）的细胞在低p-RPS6染色的细胞中高度富集（图2f）。这些数据证实了SLC3A2在MM中调节mTORC1信号，并表明致癌RAS也是激活mTORC1所必需的。
图2 SLC3A2与RAS结合并调控mTORC1活性
3、RAS控制LAMP1+（溶酶体相关膜蛋白阳性）溶酶体上SLC3A2与mTOR的关联
作者发现SLC3A2与MTOR的关联在RAS敲除后持续下降（图3a）。接下来，作者使用PLA可视化内源性MTOR和SLC3A2之间的相互作用，在整个细胞质中产生明亮的斑点（图3b，红色）。MTOR-SLC3A2 PLA具有特异性，因为其组成部分MTOR和SLC3A2的敲除几乎消除了PLA信号（图3c）。RAS敲除后，BioID2-SLC3A2相互作用物减少，这些蛋白在与囊泡和膜组织相关的途径中富集（图3d），表明RAS可能控制SLC3A2在膜上的定位。为了测试RAS是否调节SLC3A2向内溶酶体的定位，作者在SLC3A2和内溶酶体标记物LAMP1之间建立了PLA对。在RPMI 8226和SKMM1 MM细胞的细胞质中观察到SLC3A2-LAMP1聚乳酸点（图3e，红色）。这种相互作用是特异性的，因为SLC3A2的敲低显著破坏了SLC3A2- LAMP1的PLA信号（图3f）。RPMI 8226和SKMM1中MTOR和LAMP1的免疫荧光显示，MTOR在整个细胞质中形成灶，与LAMP1染色重叠（图3g）。MTOR-LAMP1 PLA对（图3h）结果显示MTOR敲低可显著降低PLA信号（图3i），且 RAS敲低可显著降低MTOR与LAMP1的关联（图3i）。最后，作者发现SLC3A2的表达是MTOR与LAMP1共定位所必需的（图3i），这表明RAS、SLC3A2和MTOR的表达都是这些蛋白驻留在内溶酶体膜上所必需的。
图3 RAS调节SLC3A2和MTOR在溶酶体上的定位
4、mTORC1活性是骨髓瘤中RAS信号的主要特征
磷酸化蛋白富集试验表明，mTORC1途径和MAPK（丝裂原激活蛋白激酶）途径是SKMM1细胞中重要的RAS效应途径（图4a）。NRAS敲低导致mTORC2组分及其下游信号效应物（MAPKAP1、AKT1、PRKCA）磷酸化增加（图4b）。KRAS或NRAS敲低会降低mTORC1靶点p70S6K和4EBP1 的磷酸化水平（图4c）。MTOR与四种MM细胞系中外源性表达的KRAS或NRAS突变异构体共免疫沉淀，在MM细胞中与RAS异构体相关（图4d）。接下来，作者通过PLA确定了内源性MTOR和RAS与RPMI 8226和SKMM1 MM系相关（图4e，红色）。MTOR和RAS同工异构体的敲低抑制了PLA信号，并证实了该PLA对的特异性（图4f）。RPTOR（mTORC1的一个组件）的敲低显著降低了RPMI 8226和SKMM1细胞中MTOR-RAS PLA点的数量（图4g）。然后作者发现RAS、MTOR和SLC3A2在RPMI 8226和SKMM1 MM细胞中与LAMP1共定位 （图4h，黄色箭头），表明SLC3A2、RAS和MTOR在MM细胞内的LAMP1囊泡上形成复合物。
图4 RAS控制多发性骨髓瘤中mTORC1的活性
5、致癌RAS协同氨基酸感应激活mTORC1
在BioID2实验中，RAS与mTORC1信号的多个组分相关，包括LAMTOR3、RRAGC和ARF1（图5a）。作者使用PLA检测RAS与RAGC（调控子的一个组成部分）和ARF1（可以作为谷氨酰胺传感器激活mTORC133）的相互作用，发现RAS存在于mTORC1活性信号传导部位（图5b）。TSC2缺失（可激活mTORC1）显著增加了4EBP1 和p70S6K 的磷酸化，但这些磷酸化水平升高仍然依赖于RAS表达（图5c）。然后，作者发现在谷氨酰胺限制下，SLC3A2变得不那么重要（图5d, e），这表明在正常条件下，SLC3A2的氨基酸转运蛋白功能是必需的。12小时的谷氨酰胺限制大大降低了RAS-MTOR PLA（图5f），这表明SLC3A2的氨基酸转运蛋白功能在调节RAS依赖性mTORC1激活中的作用。
图5 致癌RAS通过选择氨基酸感应机制激活mTORC1
6、多发性骨髓瘤患者的RAS和mTORC1信号
作者在检测的MM患者样本子集中，观察到CD138（浆细胞的标记物图，6a，白色）细胞的细胞质中有许多MTOR-RAS PLA点（图6a，红色）。用100nM依维莫司处理SKMM1和XG2细胞，在3和8小时通过RNA测序检测相对于DMSO对照的基因表达变化。在两种细胞系中，表达量平均降低至少0.5 log2fc的基因如图6b所示。作者将mTORC1信号应用于多发性骨髓瘤研究基金会研究中的859例患者的基因表达数据，并使用Cox比例风险模型确定其与该患者队列中的疾病特异性生存率显著相关（图6c），这表明mTORC1信号与MM的不良预后相关。并且，mTORC1信号在含有KRAS、NRAS或FGFR3突变的MM样品中显著富集 (图6d)，验证了原发性MM病例中致癌RAS信号和mTORC1活性之间的联系。
图6 RAS依赖性mTORC1活性在原发性多发性骨髓瘤中的作用
7、联合抑制mTORC1和MEK1/2对RAS依赖性MM具有毒性
为了改善mTORC1抑制剂在MM中的应用，作者进行了高通量组合药物筛选，以评估依维莫司与MIPE v5.0文库之间的协同作用，该文库包含2450种机制注释、肿瘤聚焦化合物，这些化合物在一系列6 × 6基质块中存在于SKMM1和RPMI 8226细胞中（图7a）。这些筛选揭示了依维莫司与通过MEK和ERK靶向经典MAPK信号的抑制剂之间的特殊协同作用（图7b-f）。作者在MM队列中评估了依维莫司与MEK1/2抑制剂曲美替尼的联合治疗效果（图7g，左）。与筛选数据一致，曲美替尼作为单一药物只有中度的生长抑制作用（图7g，左侧蓝线）。联合治疗（粉色）基本上阻止了肿瘤的生长，并且明显比对照（黑色）、依维莫司（绿色）或曲美替尼（蓝色）单独治疗有效（图7h）。除了抑制MM肿瘤生长外，与对照或单药治疗小鼠相比，联合治疗延长了生存期，并且所有联合治疗小鼠在治疗窗口结束时都存活（图7i）。这些数据表明，具有活跃RAS信号的肿瘤的MM患者可能特别受益于mTORC1和MEK1/2抑制剂的组合。
图7 针对RAS依赖的mTORC1信号的联合治疗
结果
综上所述，作者的数据表明，依赖RAS、SLC3A2和MTOR复合物信号传导的恶性细胞对mTORC1和MEK抑制剂非常敏感。PLA可视化MTOR-RAS关联可以作为一种优秀的生物标志物，可以在即使没有已知RAS突变的情况下用于识别将受益于这种联合治疗的MM患者。因此，此研究介绍了致病性RAS信号传导的一个以前未表征的概念，并概述了利用这种信号传导机制的潜在治疗机会。
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