本期解读的由武汉大学的团队在J Immunother Cancer杂志上发表的关于鸟苷酸结合蛋白2（GBP2）作为微卫星稳定性结直肠癌亚型潜在的免疫治疗靶点的一篇文章。
背景
结直肠癌（CRC）在全球死亡率方面排名第三，大约15%的CRC是缺陷-失配-修复型或微卫星不稳定型（dMMR/MSI），其余85%是经典的MMR或微卫星稳定性（pMMR/MSS）。近年来免疫检查点阻断（ICB）的发展改变了抗癌治疗干预领域，包括使用靶向程序性细胞死亡1（PD-1）、程序性细胞死亡配体1（PD-L1）或细胞毒性T淋巴细胞抗原4（CTLA4），然而，并非所有结直肠癌患者都受益于ICB，缺乏免疫细胞浸润和低肿瘤突变负担（TMB）是免疫抵抗的机制。一些研究表明，与其他具有不同作用机制的药物联合使用可以潜在地克服耐药性。在本文中，作者将1424例pMMR / MSS CRC患者分为两类，“免疫”和“非免疫”，鸟苷酸结合蛋白2（GBP2）作为目的基因。GBP2是GTP酶家族的成员，对宿主对病原体的免疫至关重要。GBP2用作干扰素（IFN）反应性的标志物，因为它是IFN-γ刺激后表达最高的基因之一。研究表明在CRC中，GBP2的上调可以抑制CRC的生长，并增加紫杉醇耐药的CRC细胞对紫杉醇的敏感性。目前的研究揭示了GBP2与高CD8+T细胞浸润，APM和趋化因子（C-X-C基序）配体10/11（CXCL10/11）表达的高度相关性。
结果
1
pMMR/MSS CRC 中存在免疫类别
作者通过在六个独立的pMMR / MSS CRC队列中应用基于基因表达的共识聚类方法对MSS CRC患者进行分层。结果发现，MSI肿瘤与高度浸润的MSS肿瘤之间表现出识别免疫细胞或免疫反应的特征显著富集（图 1A、C），将这两个特征称为免疫类（IC）和非免疫类（non-IC）。与非IC相比，IC组和MSI组的T细胞发炎基因表达谱（GEP）、先天抗PD-1耐药性（IPRES）和免疫预测（IMPRES）评分更高（图1B、D）。综上所述，这些数据表明pMMR/MSS CRC样本中存在免疫异质性。
图1. 鉴定pMMR/MSS CRC中两种不同的基于肿瘤微环境的免疫类别
2
在 IC 中 GBP2 表达上调
作者分析了COAD队列中IC和非IC之间的DEGs，获得21个差异表达的RNA结合蛋白（RBP）。通过单因素Cox比例风险回归分析，最终获得682个基因（图2A）。分析前五个显著上调的基因与上述免疫特征之间的相关性，发现S100钙结合蛋白B（S100B）和GBP2呈显著正相关（图2B、C）。与正常样品相比，MSI-L/MSS CRC中的GBP2表达显著降低（图 2D）。IC和MSI组中GBP2的上调在六个独立的CRC队列中得到了验证（图2E）。CMS1亚型表现出最高的GBP2表达，而CMS2亚型表现出最低的GBP2表达（图2F）。两个队列的数据显示，GBP表达高的患者在几种免疫相关途径和功能方面显著富集，尤其是干扰素γ（IFN-γ）反应、IFN-γ介导的信号通路和T细胞活化（图 2G， H）。综上所述，这些发现表明GBP2主要通过调节IFN-γ反应和T细胞活化来参与pMMR / MSS CRC的免疫应答。
图2.鉴定GBP2作为目的基因
3
GBP2低表达与结直肠癌患者预后不良有关
作者探讨了GBP2在结直肠癌中的预后作用。结果表明，GBP2 的低表达预示着 OS较差，并且无复发生存期（图2I）。GBP2低表达组（35.1%，199/567）的原发性转移患者数量明显高于高表达组（10.2%，58/568）（图2J）。因此，GBP2可能与结直肠癌转移密切相关。
4
GBP2表达与pMMR/MSS CRC肿瘤CD8+T细胞浸润呈正相关
作者分析了来自 8 名 MSS CRC 患者的单细胞 RNA 测序数据（图 3A），发现 GBP2 表达最高的两名患者的 CD4 + 和 CD8+ T 细胞浸润显著增加（图 3B、C）。此外，GBP2 在六个队列中与 CD8A（CD8蛋白分子的一段）呈正相关（图 3D）， GBP2 表达与发炎的免疫微环境之间存在很大相关性，并且主要与六个队列中的 CD8 + T 细胞呈正相关（图3E），GBP2与大多数抗肿瘤免疫步骤高度相关（图3F）。
进一步证明 GBP2 的高表达与 pMMR/MSS CRC 中较高的肿瘤 CD8+T 细胞浸润有关，作者纳入62 个 MSS CRC 样本用于后续分析，发现具有高百分比 GBP2 阳性的样本显示出更高的 CD8 和 PD-L1 阳性百分比和细胞计数（图 4A、B），GBP2 阳性百分比与 CD8 和 PD-L1 阳性百分比呈正相关（图 4C、D）。与非IC组相比，IC组的GBP2阳性率更高（图4E）。生存分析表明，在 TMA 队列的 MSS CRC 中，高百分比的 GBP2 阳性与更好的 OS 相关（图 4G）。综上所述，这些结果表明 GBP2 与 pMMR/MSS CRC 中更高的 CD8+T 细胞浸润相关（图 4F）。
图3. 高GBP2表达与生物信息学方法的CD8+T细胞浸润有关
图4.高 GBP2 表达的验证与 CD8+T 细胞浸润有关
5
GBP2表达与pMMR/MSS CRC中IFN-γ刺激下CXCL10和CXCL11的表达和分泌呈正相关
由于GBP2表达与较高的CD8+T细胞浸润高度相关，作者分析了GBP2表达与CXCL家族之间的关系，发现在六个队列中，GBP2表达与CXCL9，CXCL10，CXCL11和CXCL13水平显著正相关（图5A）。然而，在 IFN-γ 刺激下，GBP2 敲低细胞中 CXCL10/11 的 mRNA 水平显著下调（图 5B、C）。ELISA结果进一步证实，下调GBP2可抑制CXCL10和CXCL11响应IFN-γ的蛋白表达（图5D、E）。总之，这些结果表明 GBP2 的高表达与 CXCL10 和 CXCL11 的更高表达和分泌相关。
图5.GBP2表达与CXCL10/CXCL11和APM表达较高的表达和分泌呈正相关
6
在 pMMR/MSS CRC 中，GBP2 表达与 IFN-γ 刺激下 HLA-I APM 的表达呈正相关
细胞毒性 CD8+T 细胞可以通过识别癌细胞上的 HLA I 类 （HLA-I） APM 来杀死肿瘤细胞，作者发现 GBP2 表达与六个 CRC 队列中的 HLA-I APM 表达显著正相关（图 5F）。具有高 GBP2 表达的患者不仅具有更高水平的 CD8+T 细胞浸润，而且在六个 pMMR/MSS CRC 队列中具有更高水平的 HLA-I APM 表达（图 5G ），GBP2 敲低细胞中 HLA-I APM 表达显著降低（图 5H，I），流式细胞术也发现 GBP2 的敲低抑制了 IFN-γ 刺激下 MHC-I 的表达（图 5J，K）。总之，这些结果表明高 GBP2 表达与更高表达的 HLA-I APM 相关。
7
GBP2 的上调通过与 SHP1 竞争结合 pMMR/MSS CRC 中的磷酸化信号转导和转录激活因子 1 来增强信号转导和转录激活因子 1 磷酸化的激活
从机制上说明 GBP2 对 pMMR/MSS CRC 免疫微环境的影响，作者发现 GBP2 的沉默减少了 HT29 和 SW480 细胞中磷酸化 STAT1 （p-STAT1） 的激活（图 6A）。在 GBP2 沉默的细胞中重建 GBP2 可以增加 p-STAT1 的激活（图 6B）。此外，STAT1 磷酸化可以通过直接与负调节剂相互作用来抑制，例如含有 SH2 的蛋白酪氨酸磷酸酶 1 （SHP1）。在使用非特异性酪氨酸磷酸酶抑制剂Na 3 VO 4处理后，可以挽救上述降低的 STAT1 磷酸化（图 6C），下调 SHP1 会损害 GBP2 沉默细胞中的 STAT1 去磷酸化（图 6D），并且GBP2 和 SHP1 与 STAT1 具有相似的相互作用域（图 6E、F）。此外，在 GBP2 沉默的细胞中，SHP1 和 p-STAT1 之间的相互作用增加（图 6G）。总之，这些结果表明 GBP2 通过与 SHP1 竞争结合 STAT1 来增强 STAT1 磷酸化。
图6. STAT1磷酸化减少是由GBP2的下调介导的
8
GBP2 损失削弱了体内 PD-1 阻断的功效
作者推测 GBP2 可能会影响免疫疗法在 pMMR/MSS CRC 中的疗效，生物信息分析结果表明GBP2 和 PD-L1 之间存在高度相关性（图7A-D）。为了验证假设，作者构建了两个缺乏 GBP2 的 CT26 细胞系（图 7E），发现在植入免疫缺陷 NSG 小鼠的 GBP2 KO 肿瘤中仅观察到肿瘤体积略有增加（图 7F）。流式细胞术、免疫组化分析表明，GBP2-KO 组中的肿瘤具有较低水平的 CD3 + CD8 + T 细胞，瘤内 CD8a、MHC I 类和 CXCL10/11 表达也与 CRC 肿瘤中的 GBP2 水平正相关（图7G-L）。总之，这些结果表明表达高水平 GBP2 的肿瘤对抗 PD-1 疗法敏感（图 7M）。
图7. GBP2 的高表达对于 pMMR/MSS CRC 中对 PD-1 阻断的反应至关重要
讨论
本研究将 pMMR/MSS CRC 分为免疫类和非免疫类，并确定 GBP2 是与 ICB 联合治疗的有希望的靶标，并且首次揭示了 GBP2 促进 pMMR/MSS CRC 中 STAT1 磷酸化的新机制。这些工作将加深人们对免疫微环境的理解，并有助于为 pMMR/MSS CRC 提供精准的免疫治疗。
往期回顾
【1】PD-1新机制：ERK和USP5通过去泛素化调控PD-1稳态进而调节肿瘤免疫治疗
【2】IF=11.60|肝细胞治疗新靶点—14-3-3σ蛋白降低失巢凋亡耐药性
【3】Nature Menin抑制剂Revumenib为急性髓系白血病癌症患者带来希望！
【4】IF=41.44|去甲基化酶ALKBH5通过PKMYT1 m6A修饰抑制胃癌侵袭
