非酒精性脂肪肝新靶点——MPC1调节脂肪酸合成酶乳酸化

来自中国农业大学的黄昆仑团队在Hepatology杂志（IF=17.42）上发表了题为“Mitochondrial pyruvate carrier 1 regulates fatty acid synthase lactylation and mediates treatment of nonalcoholic fatty liver disease”的学术论文。该研究检测了非酒精性脂肪肝病患者的肝组织中的线粒体丙酮酸转运体1表达的变化，探究了线粒体丙酮酸转运体1系统杂合子敲除小鼠的代谢表型和参与肝脂积累的基因表达，利用串联质谱标记蛋白质组学检测了肝蛋白质乳酸化，并通过细胞中过表达乳酸化突变体进行验证。最后，探讨了线粒体丙酮酸转运体1抑制对小鼠和AML-12细胞中肝炎的影响。该研究为寻找治疗非酒精性脂肪肝病新靶点提供了新的依据。

背景

       为探究MPC1与NAFLD的关系，作者对43例NAFLD患者和7例正常肝脏患者的肝组织进行了MPC1的免疫组织化学染色。与正常组相比，NAFLD（NAS≤4）和NASH（NAS≥5）患者MPC1表达显著增加（图1A）。相关性分析显示，虽然MPC1表达与炎症、纤维化、ALT或AST无相关性（图1B），但与NAFLD患者肝脏脂肪变性的程度和百分比显著相关（图1C和D）。在HFD喂养18周的小鼠肝脏中，MPC1表达上调（图1E），qPCR和Western blotting验证了这一结果（图1F，G）。进一步研究也证明小鼠肝脏中MPC1表达与脂肪变性程度呈正相关（图1H）。此外，MPC1在高糖高脂喂养的小鼠（图1I，J）以及在油酸和棕榈酸处理的AML-12和HepG2细胞中的表达上调（图1K，L）。综上，作者的结果表明，MPC1的上调可能在NAFLD的发生和发展中发挥重要作用。

为了继续探索细胞内MPC1抑制对脂质代谢的影响，作者接下来使用正常小鼠AML-12肝细胞系在体外证实了他们的发现。MPC特异性抑制剂UK5099处理后，NEFAs和TG含量显前著降低（图2J，K）。ORO染色也显示，MPC抑制可显著减少AML-12细胞的基于先的结果，作者建立了MPC1^+/-小鼠模型，并给予为期18周高脂饮食处理。与WT小鼠相比，LFD或HFD的MPC1^+/-小鼠表现出体重减轻（图2A）。值得注意的是，喂食HFD的MPC1^+/-小鼠肝脏体重比显著降低（TG水平和H&E染色显示MPC1^+/-小鼠肝脏脂质沉积明显改善（图2F，G）。MPC1^+/-小鼠肝脏NAS评分明显降低，脂肪变性程度改善（图2H，I）。这些数据表明MP图2B），血清TG浓度降低，高密度脂蛋白水平显著升高（图2C-E）。肝脏C1^+/-小鼠肝脏脂质沉积减少。脂质沉积（图2L）。作者在HepG2细胞中也得到了相似的结果（图2M）。

综上，这些结果表明MPC1敲除可改善高脂饮食导致的过度脂肪堆积。

为了进一步探索MPC1敲除改善肝脏脂质堆积的机制，作者检测了脂质代谢通路中关键酶和转录因子的表达。与肝脏脂质堆积显著减少相反，MPC1^+/-小鼠中大多数脂质代谢相关基因（Srebp1-c、Fasn、Acc等）的mRNA表达水平没有明显变化（图3A）。此外，除PGC1α外，DNL通路中大多数关键蛋白的表达水平，如FASN和ACC，也没有明显差异（图3B）。接下来，作者使用两种不同的siRNAs敲除AML-12细胞中的MPC1，这显著降低了MPC1的表达（图3C）。ORO染色以及NEFAs和TG含量定量显示，MPC1 siRNA处理减少了AML-12细胞的脂质积累（图3D）。为了系统地评估MPC1敲除的效果，作者进行了无标记蛋白质组学研究。结果表明，MPC1 siRNA处理不改变脂质代谢途径中的蛋白表达（图3E）。作者进一步验证了蛋白质组学结果，发现大多数关键DNL基因的表达不受影响（图3F, G）。

这些结果证实，MPC1的下调可以减少肝脏脂质积累，而不影响脂质合成相关关键基因的表达。

作者对WT和MPC1^+/-小鼠血清进行非靶向代谢组学分析，发现差异代谢产物在氨基酸相关通路中富集（图4A）。MPC1敲除导致乳酸水平显著升高，这可能与丙酮酸积累引起的乳酸合成激活有关（图4B）。此结果伴有肝脏LA水平升高（图4C）。在MPC1敲除后，NAFLD小鼠肝脏中的蛋白质乳酸化水平显著改变，某些蛋白质的乳酸化增加（图4D）。

作者对MPC1^+/-和WT小鼠的肝脏进行了乳酸化蛋白质组学研究。作者鉴定出528个蛋白和1526个修饰位点，其中39个蛋白和47个位点在MPC1敲除后发生差异修饰（图4E, F）。在COG功能分类中，差异乳酸化蛋白富集在“代谢过程”和“生物调节”等生物过程中，特别是“能量产生与转换”和脂质运输与代谢”两类（图4G）。KEGG功能通路分析也显示了胰岛素敏感性和脂肪酸代谢通路的富集，这与NAFLD的发展有关（图4H）。然而，由于在MPC1^+/-小鼠肝脏中未观察到脂代谢相关基因表达的变化（图3A），作者假设其他蛋白质的乳酸化参与了脂代谢的调节。在乳酸化差异蛋白中，MPC1敲除后FASN的三个乳酸化位点（K528、K673和K1071）增加（图4I）。

考虑到FASN在脂肪酸合成中的重要性，作者认为FASN乳酸化是MPC1调节肝脏脂质代谢的一种新机制。

作者比较了FASN蛋白序列的同源性，发现残基528和673附近的序列在人和小鼠之间是同源的（图5A），这表明FASN在这些位点的乳酸化可能是保守的。免疫印迹进一步证实了小鼠肝脏以及AML-12和HepG2细胞中的FASN乳酸化（图5B, C）。

为了确定MPC1抑制引起的FASN乳酸化是否会影响其活性，作者首先测量了MPC1下调肝细胞中的FASN活性，发现MPC1缺乏导致FASN活性显著降低（图5D）。有趣的是，作者还观察到NAFLD肝脏中FASN乳酸化降低，这一作用可通过MPC1敲除逆转（图5E）。总之，作者认为乳酸化可能抑制FASN活性，并有助于调节脂质代谢。

因此，作者为FASN的三个乳酸化位点生成了flag标记的抑制（MR）和过表达（MT）突变体。MT突变体的FASN活性明显低于WT FASN（图5F）。MT突变体过表达后NEFAs和TG含量显著降低（图5G, H），这与ORO染色结果一致（图5I, J）。在OA+PA处理的NAFLD模型细胞中也有类似的结果（图5I, J）。

作者对人类FASN的结构进行了建模，发现K528和K673位点都位于乙酰辅酶a和丙二酰辅酶a转酰基酶（MAT）亚基。K673位点与MAT亚基（His683）催化活性位点之间的空间距离相对较小，这提示K673很可能影响FASN活性（图5K）。因此，作者为每个乳酸化位点产生突变体，发现K673T的酶活性最低（图5L）。TG含量和ORO染色显示，无论正常或NAFLD状态，K673T过表达细胞均存在严重的脂质堆积缺陷（图5M-O）。

这些数据表明，K673乳酸化可显著抑制FASN活性，减少肝细胞脂质积累。

在之前的研究中，作者提出了一种以乳酸为基础的调控模式，通过抑制MPC1提高乳酸水平来调节FASN乳酸化，减少肝脏脂质积累。然而，据报道乳酸能激活肝脏的炎症过程。为了确认乳酸水平升高是否会加重肝脏炎症，作者检测了MPC1^+/-小鼠肝脏的炎症，发现M1巨噬细胞标记物（Cd11c和iNosA）的mRNA表达明显降低（图7A, B），而M2标记物（Arg1和Cd206）的mRNA表达明显升高（图7B）。IL-1β的免疫荧光和F4/80的免疫组化也显示MPC1敲除后整体肝脏炎症得到控制（图7C）。这些结果表明，尽管乳酸水平升高（图4C）， MPC1^+/-小鼠的肝脏炎症并未升高。值得注意的是，MPC1^+/-小鼠肝脏中的巨噬细胞表现出抗炎表型。在MPC1敲除的AML-12细胞中，TNF-α和IL-1β蛋白水平以及外分泌细胞因子和炎症因子的mRNA水平显著降低（图7D, E）。然后作者用MPC1敲除的肝细胞上清培养RAW264.7细胞，发现巨噬细胞M2极化明显，炎症因子表达降低（图7F）。此外，由于呼吸链相关基因拷贝数的增加和Sirt1-Drp1轴mRNA表达的降低（图7G, H），作者认为MPC1的下调通过抑制过度的线粒体呼吸来减弱线粒体损伤。

总之，这些结果表明，尽管MPC1抑制增加了肝脏乳酸水平，但它可能通过影响线粒体功能和Kupffer细胞来抵消乳酸的促炎作用，从而控制肝脏炎症。

结论