MucR1 调控大豆根瘤菌 c - di - GMP 生物合成的机制探讨- 大数跨境

i米立

2024-10-12

该研究由中国农业大学农业生物技术国家重点实验室、农业部土壤微生物重点实验室和根瘤菌研究中心的田长富团队完成，成员包括李梦琳、焦健、张碧良、史文涛、于文浩等。

环状二聚鸟苷酸（c - di - GMP）是细菌中普遍存在的第二信使，在生物膜形成、细胞周期和分化等关键功能和机制中起调节作用。细菌中普遍存在的第二信使 c - di - GMP 在病原体中的作用被广泛研究，但在互利共生细菌中的研究较少。根瘤菌诱导并感染豆科植物根瘤，固定大气中的 N₂为氨以支持植物生长，其能量消耗过程由宿主细胞提供的营养维持，且能在土壤中腐生，代表着一种典型的兼性微共生体。尽管根瘤菌物种的泛基因组开放，且单个基因组中有数十个 c - di - GMP 信号组件，但根瘤菌中的 c - di - GMP 信号传导仍未被充分探索。

1.筛选功能 DGCs：

对Sinorhizobium fredii CCBAU45436 进行全基因组生物信息学分析，确定含有 GGDEF、EAL 和 HD - GYP 域的蛋白质，以推测完整的 c - di - GMP 信号可能存在于该菌中。通过在大肠杆菌中异源表达 SF45436 中含 GGDEF 域的蛋白质，并进行刚果红结合试验，验证其活性。同时，通过 Western blot 分析检测蛋白质的表达情况，并用高效液相色谱 - 质谱（HPLC - MS）分析 c - di - GMP 和 pGpG 的含量，以确定蛋白质的酶活性。

2.分析功能 DGCs 的转录谱及 c - di - GMP 对共生的影响：

对功能 DGCs 进行转录组测序（RNA - seq），分析其在指数生长期、稳定期的自由生长培养和大豆根瘤中的转录谱，以了解其转录情况。通过构建缺失突变体（如 Δb52570、Δc17580、Δc17580Δb52570 等）和过表达菌株（如携带 nifH 启动子驱动的功能性 DGC SFc17580 或活性 EAL 域的 SFc33230 的菌株），测试 c - di - GMP 水平升高对共生性能的影响，包括对大豆叶绿素含量、根瘤数量等的影响。

3.研究 MucR1 对功能 DGCs 的直接调控作用：

对大豆根瘤和在丰富培养基 TY 中自由生长的细胞进行 qRT - PCR 分析，比较野生型 SF45436 和 ΔmucR1 突变体中功能 DGCs 的转录水平，以了解 MucR1 对其转录的影响。对编码功能或非功能 DGCs 的基因上游间区进行序列分析，确定其 % GC 含量，并与基因组平均值和染色体、质粒等的平均值进行比较。通过电泳迁移率变动分析（EMSA），用纯化的 Sumo - MucR1 及其衍生物 MucR1（去除 Sumo）与编码功能 DGCs 和 PDE SFc33230 的基因启动子区域的 Cy5 标记的 DNA 探针孵育，观察 MucR1 与这些基因的结合情况。

综上所述，该研究通过多方面的实验，系统地揭示了 MucR1 对大豆根瘤菌中功能 DGCs 的转录抑制作用，以及 c - di - GMP 在共生中的作用。

1.研究内容系统全面：对 Sinorhizobium fredii CCBAU45436 中与 c - di - GMP 相关的功能 DGCs 进行了全基因组的筛查和鉴定，包括异源表达验证、酶活性测定、转录组分析以及与共生性能的关联研究等，系统地揭示了 c - di - GMP 在该菌与大豆共生中的作用。

2.实验设计严谨：通过多种实验技术和方法，如刚果红结合试验、Western blot、HPLC - MS、RNA - seq、qRT - PCR、EMSA 等，对研究假设进行了多角度的验证，实验数据相互支持，结论可信度高。

3.创新性强：揭示了 MucR1 对功能 DGCs 的全局转录抑制在大豆 - 根瘤菌共生中的重要作用，为理解 c - di - GMP 在互利共生中的调控机制提供了新的视角，具有一定的创新性。

1.未深入探讨 MucR1 具体的调控机制：虽然文章揭示了 MucR1 可以直接结合功能 DGCs 和 PDE SFc33230 的基因启动子区域，但对于 MucR1 如何实现这种全局抑制以及其与其他调控因子的相互作用等具体机制，尚未进行深入探讨。

2.对 c - di - GMP 响应过程的研究不够全面：文章提及了 c - di - GMP 诱导的一些响应过程，如与运动性、生物膜形成、毒力和细胞周期等相关的过程，但对于这些过程在大豆 - 根瘤菌共生中的具体作用和调控网络，还需要进一步的研究来完善。

1.全面解析 c - di - GMP 响应过程在共生中的作用：鉴定更多受 c - di - GMP 调控的基因和生物学过程，构建 c - di - GMP 响应基因的调控网络。探索如何通过调节 c - di - GMP 信号通路来优化大豆 - 根瘤菌共生体系，提高农业生产效益。

2.寻找其他调控因子并研究其协同作用：通过基因组学、转录组学等方法，筛选可能参与功能 DGCs 基因表达调控的其他因子。研究这些调控因子之间的相互作用关系，以及它们如何协同调节 c - di - GMP 信号通路。

3.临床应用潜力的探索：鉴于 c - di - GMP 在细菌中的广泛作用，研究根瘤菌中 c - di - GMP 信号通路与病原菌中相关通路的差异和联系。探索是否可以通过靶向根瘤菌中的 c - di - GMP 信号通路来开发新的抗菌策略或促进植物健康生长的方法。研究根瘤菌与其他微生物群落的相互作用，以及 c - diGMP 信号通路在其中的调节作用，为农业生态系统的可持续发展提供理论基础。

文章作者：邵程祥

图文编辑：马文博

欢迎关注i米立，每周分享国自然相关文献，拓展科研思路！

点击下方“粒成生物”并关注，在后台留言‘1V1’既可获得免费与专业顾问1V1国自然SCI方向的定制化方案！