Nature Communications| 海马体与前额叶皮层如何控制我们的进退行为

《Nature Communications》近期发表了一篇题为《Two opposing hippocampus to prefrontal cortex pathways for the control of approach and avoidance behaviour》的论文，探索了海马和前额叶皮层(PFC)这一回路是如何组织起来在不同的时间灵活地选择促进接近或回避的机制。

人们认为，决定接近或避开一个潜在的威胁环境，依赖于海马和前额叶皮层(PFC)中不同神经元的协调活动。这篇文章探索了这一回路是如何组织起来在不同的时间灵活地选择促进接近或回避的机制。发现海马到PFC的投射是由位于CA1/下托（subiculum）边缘的浅层或深层两个平行回路组成的。这些回路具有独特的上游和下游连接，并在接近和回避行为中具有不同的活性。浅层回路优先连接广泛的PFC抑制性中间神经元，其激活促进探索；而深层回路与PFC锥体神经元和快速尖峰中间神经元相连，其激活促进了回避。这共同提供了一种机制来调节避趋冲突的行为：通过两个专门的，平行的回路，允许海马双向控制PFC。

为了研究从vH到PFC投射的细胞组织，研究者注射了逆行示踪剂霍乱毒素(CTXβ)对投射到PFC的神经元进行标记，观察vH中荧光标记神经元的分布。vH脑片为横切片，用以保持三突触回路，更容易地识别不同海马区神经元的分布。发现vH亚区域CA1和下托都有表达示踪剂的细胞分布，且在锥体层内的分布不均匀，并始终沿着CA1/下托轴分成两簇。

然后利用无监督高斯混合模型(GMM)也将神经元沿径向轴的两簇。其中vH-PFC投射沿CA1/下托边界呈连续分布，且沿vH的径向轴分离。标记的神经元于CA1和下托分布在由 ABA 定义的 CA1 和近端下托边界周围的整个区域，这两个区域之间没有明显的分隔，因此，大约一半的标记神经元同时存在下托中。两层vH-PFC神经元在下托中并没有精确地映射到海马区基因表达图谱（HGEA）中定义的层。浅层与Ⅱ层相对应，而深层位于Ⅲ层和Ⅳ层的交界处。这些结果表明vH-PFC神经元分布在远端CA1/近端下托边界，但在径向轴上形成两层，即在下托中对应于浅层（II层）和深层（III/IV层）。

传统观念认为腹侧CA1/下托有平行的输出通路，每个神经元只投射到一个下游区域。然而，还有一小部分的神经元将侧枝投射发送到多个区域，但（在深/浅层）比例一致。为了研究两个vH-PFC层是否含有不同比例的双投射神经元，作者分别在PFC和伏隔核(NAc)或PFC和外侧下丘脑(LH)注射了荧光霍乱毒素。

示踪剂的整体共定位——表明对两个区域的间接投射，在NAc和LH实验中，有一小部分神经元同时标记了两种示踪剂，这表明它们向两个区域都发送了侧枝。

这些分布在vH-PFC的双投射神经元，近80%位于深层，极少位于浅层。因此，投射到PFC的vH神经元只有非常有限的侧枝化，且那些有侧枝的神经元优先出现在深层，而不是浅层。

接下来，作者利用钙结合蛋白 (Calb1) 的表达——一种已知特定于 CA1和 下托的基因来靶向两个 vH-PFC 层。对照分析结果证实了Calb1在vH中CA1/下托边界的浅层选择性表达，并且这种浅层表达与以CTXβ标记的vH-PFC浅层投射神经元重叠。将表达荧光的逆行 AAV 注入 Calb1-IRES-cre 小鼠的 PFC。这种技术会让海马区域投射PFC并表达Calb1的神经元带上一种颜色（Calb+/青色）,而投射PFC但是不表达Calb1的神经元带上另一种颜色（Calb-、洋红色）。海马区域投射PFC的神经元，大多数浅层神经元表达Calb1，而大多数深层神经元不表达Calb1。

为了研究这两个vH-PFC层的特性是否与之前确定的浅层和深层海马的回路相对应，作者对在PFC注射逆行示踪剂的小鼠 vH横切片进行了靶向全细胞电流钳记录。取横切片中分层最明显的地方——前文分析表明是近端下托。通过在浅层和深层依次记录逆行标记的神经元对，比较其内在的电生理特性。用形态染料填充神经元后，使用双光子显微镜重建这些记录的神经元对的树突形态。结果表明浅层神经元形态致密，树突分叉较早，而深层神经元的树突相对稀疏，但较长。电生理学上，浅表神经元以规则放电为主，Ih高，而深层神经元更容易爆发放电，Ih更低。这些记录进一步表明vH-PFC投射由两个神经元群体组成，每个都起源于经典描述的CA1/下托交界的浅层和深层。

为了研究是否存在这种情况，作者使用了一种基于狂犬病病毒的逆行追踪技术——追踪输入和输出之间的关系(TRIO)，追踪投射到PFC的vH神经元的输入。发现vH-PFC神经元的密集输入来自许多局部和远程区域。

接下来，作者使用通道视紫红质辅助电路映射(CRACM)来研究每一层的功能输入。在前期的实验中确定的4个标记最密集的区域中——海马CA3、内嗅皮层(ENT)、丘脑前部区域的分散簇，集中在室旁丘脑(ATh)周围，以及包围腹侧内侧隔和布罗卡斜带的区域(DBB），使用AAV注射液，利用泛神经元突触素启动子，来表达通道视紫红质-2(Chr2)。2周后制作vH的急性横切片，并对每层PFC投射神经元进行逆行标记，进行连续配对的全细胞电流钳记录。使用短的蓝脉冲(473 nm)光直接比较来自每个传入区域的vH-PFC浅层或深层神经元的体细胞突触输入的相对影响。发现当CA3末端刺激导致浅层和深层神经元的兴奋性突触驱动大致相等，ENT输入的影响偏向于浅层神经元，DBB和ATh输入的影响都明显偏向于深层神经元。两类vH-PFC神经元受到传入输入的不同驱动--两类神经元都接受密集的CA3输入，但皮质输入的影响偏向于浅层细胞，而丘脑和基底前脑的影响则偏向深层细胞。

为了研究局部PV+中间神经元在每一层上的连通性，作者在PV-IRES-Cre小鼠中使用AAV注射，在vH的PV+中间神经元中表达ChR2，并使用逆行示踪剂标记PFC投射的神经元，2周后，对每一层进行连续配对的全细胞电压钳记录。发现ChR2介导的vH中PV+中间神经元的激活导致了vH-PFC浅层和深层神经元中有强大而等效的IPSCs(诱导性多能干细胞)。但根据此前的报道，PV+中间神经元优先抑制深层神经元。

因此，在同一切片上，作者又记录了邻近的未标记的浅层和深层神经元，并证实深层的非PFC投射的vH神经元比浅层接受更多的PV+输入。因此，vH-PFC投射神经元被特定地连接起来，以确保跨两层的同等抑制。

接下来，为了研究各层vH-PFC神经元对局部中间神经元的兴奋性输入，作者将表达cre重组酶的逆行AAV注射到PFC中，并将AAV混合物的注射到vH中以表达荧光标记的体细胞通道视紫红质(soCoChR2)和在中间神经元特异性dlx启动子的控制下的荧光标志物mRuby。证实了dlx启动子是识别vH中中间神经元的合适工具。

在另一个单独的实验中，作者证实了soCoChR2阴性细胞对光不敏感。因此，这种方法允许我们在各层PFC投射的单个神经元使用聚焦光斑来激活体靶向CoChR2，同时记录vH中邻近的中间神经元。

使用这种方法，发现各层的PFC投射神经元以相似的连接概率和突触强度连接到局部中间神经元。结合上面识别的不同传入输入，这表明两个vH-PFC回路以一种可能促进两层横向抑制的方式连接，以促进它们在不同时间点的活动。

作者将AAV注射到Calb1-IRES-cre小鼠的vH中，使其在(浅层)神经元(Creon ChR2)中表达，在另一项单独的实验中，注射另一种AAV，使其只在cre阴性的(深层)神经元中表达(creOFF ChR2)。研究浅层和深层vH-PFC神经元是否支配PFC内独特的空间位置。

根据PFC的冠状切片，研究这些神经元的轴突分布。发现，两层轴突在AP、ML或DV轴上的分布没有明显差异。这表明，尽管vH-PFC神经元接受了不同的传入输入，但它们支配着相似的区域和PFC层。

作者在PFC中使用了来自抑制性中间神经元(使用VGAT+起始细胞)或兴奋性神经元(使用CaMKII+起始细胞)的单突触狂犬病追踪。比较vH中被狂犬病逆行标记的神经元和同时注射CTXβ标记的神经元在前额叶中的分布。因此，在本实验中，所有vH-PFC神经元都被标记为CTXβ，而vH-PFC兴奋性神经元或抑制神经元被标记为狂犬病。

计算在PFC中抑制性中间神经元（VGAT+）和兴奋性神经元的每一vH层中狂犬病标记神经元的比例。发现vH每一层对PFC中兴奋性和抑制性神经元的靶向不同。虽然，浅层和深层的vH神经元都以PFC的中间神经元为目标，但PFC的锥体神经元（它们是哺乳动物皮质结构中数量最多的兴奋性细胞类型）的输入优先来源于深层的神经元。

追踪实验表明，在PFC中，浅层神经元更容易与抑制性中间神经元连接，而深层神经元则与抑制和兴奋混合连接。

接下来，作者又通过新的实验确认这种不同的靶向。首先通过调查是否有vH-PFC神经元对抑制性标志物VGAT呈阳性，确认Calb1 creON神经没有受到可能也表达钙结合蛋白的长距离抑制性投射的污染

然后利用电生理技术在NMDA受体拮抗剂APV存在的情况下，对这些动物的PFC急性切片中的深层锥体神经元进行了全细胞电压钳记录，记录-70 mV(主要是AMPA介导的兴奋电流)和0 mV(主要是GABA介导的抑制电流，由局部中间神经元的双突触前馈抑制介导)的光诱发突触输入。并评估了相对的兴奋和抑制驱动。证明vH的浅层对PFC的前馈抑制作用比深层层大得多。

接下来作者使用CRACM来比较从浅层和深层vH神经元到PFC的相对输入，研究每层接触的抑制回路是否不同。然后检查从vH浅层或深层到每种类型相邻神经元对的相对输入。vH的浅层输入对PFC内的快峰和非快峰中间神经元都有同等程度的神经支配，这表明在PFC内树突和体细胞抑制回路都有广泛的募集。

相比之下，深层vH的输入是非常有选择性的--虽然它显示出可靠的输入到PFC的快速放电中间神经元，但几乎没有输入到邻近的非快速放电中间神经元。即主要输入胞体靶向快峰中间神经元。综上所述，vH-PFC神经元以上面这种方式连接，对PFC具有不同的兴奋性和抑制性影响。

这两组vH-PFC神经元以一种可能支持相反活动的方式联系在一起。因此，接下来作者研究了vH中的浅层和深层神经元在接近回避行为中是否有不同的活跃程度。

为此，作者使用了光纤体钙成像技术同时记录了这两类神经元的活动。利用该技术，vH中投射到PFC的Calb1+浅层神经元将表达RGeCO1a（红色荧光），而投射到PFC的Calb1-深层神经元将表达GCaMP6f（绿色荧光）。通过植入的光纤收集绿色和红色荧光，这允许在自由行为的小鼠探索EPM时，同时监测浅层和深层vH-PFC神经元的活动。

将这些记录与老鼠探索迷宫时表现出的不同行为进行了对齐，围绕喂食、伸展和低头的行为——通常被视为迷宫探索中的调查行为——（深层和浅层神经元）并没有得到一致的调节。然而，当小鼠移入 EPM 的闭合臂或张开臂时，两层的活动都发生了一致的变化，并且这种活动在进入手臂之前和手臂进入之后都很明显。有趣的是，这种活动在vH-PFC两层神经元中非常不同。我们发现，在探索迷宫张开的手臂时，浅表神经元在进入手臂前保持在基线水平，但在进入手臂后的一段时间内活动短暂增加。相比之下，深层神经元的活动在进入张开臂之前增加，但在进入手臂后，这种活动显著减少。因此，一旦进入张开的手臂，浅层和深层的活动就会发生相反的变化，这与此前的电生理数据一致。当老鼠进入迷宫的闭臂时，这些活动的变化也很明显。浅层神经元在闭臂进入前、后均无活动变化。，深层神经元在闭式手臂进入之前再次增加了活动，但与开臂相反，当老鼠进入闭臂时，这种活动保持高水平。

结果表明，两层活动的差异可以区分进入闭臂和开臂。事实上，在进入开臂时，两层之间的活动差异偏向于浅层，在进入闭臂时，活动差异偏向于深层。这表明vH-PFC投射的浅层和深层的相对活动紧密地围绕EPM的选择点进行相反的调节。

最后，作者想测试两个 vH-PFC 神经元在 EPM 探索中的因果作用。由于行为期间连接性和利用率的巨大差异，作者假设浅层和深层的人为激活可能会驱动相反的行为。再次使用基于 AAV 的方法在 vH 中的浅层（creON）或深层（creOFF）层神经元中表达 ChR2 或对照 GFP（绿色荧光蛋白），并在 PFC 中单侧植入光纤。在动物探索迷宫时用蓝光刺激从两层 vH 中的每一层到达 PFC 的轴突。多项研究表明，仅在中心点和开臂周围对 vH-PFC 回路进行瞬态操作对于定义行为至关重要 。因此，作者研究了以这种方式人为激活浅层或深层 vH-PFC 神经元群是否会影响小鼠在迷宫中的行为。结果表明，PFC 中浅层 vH 轴突的激活促进了对 EPM 开臂的探索，而激活 PFC 中的深层 vH 轴突减少了对开臂的探索。

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