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近日，北京大学生命科学学院、北大-清华生命科学联合中心胡家志课题组及合作者在《自然·通讯》（Nature Communications）上发表了题为Cas9 exo-endonuclease eliminates chromosomal translocations during genome editing的研究文章。
该工作揭示了基因编辑过程中染色体易位产生的分子机制，并针对性地设计和开发了安全性大幅提高的新型基因编辑酶Cas9TX。
Cas9TX能抑制基因编辑过程中染色体易位、大片段缺失等染色体结构异常的产生，将CRISPR-Cas9基因编辑的安全性大大提高，其编辑过程中的DNA损伤被降低到与目前流行的另外一类碱基编辑工具相当的水平。
Cas9TX可能是目前最为安全的CRISPR-Cas9编辑变体。
背景介绍
基因编辑是在细胞内可以精准改变DNA序列的生物学技术。
源自细菌防卫系统的CRISPR-Cas核酸酶是目前最为广泛使用的基因编辑工具，在基础科研以及临床应用方面都有着广阔的应用前景。
CRISPR-Cas通过向导RNA与DNA的碱基互补配对，可以在基因组上的特定位置起始DNA双链断裂，再利用细胞内源对于断裂DNA的修复完成基因修饰。
然而在完成靶向位点基因突变的同时，CRISPR-Cas还可能在与靶向位点DNA序列相似处发生切割（即脱靶活性），也会产生染色体易位以及染色体大片段缺失等染色体结构异常的情况，而后者常常与癌症的发生相关。
其中脱靶活性在领域内有着较为成熟的解决策略，各种Cas9高保真变体被开发用于减弱脱靶活性；而由于缺乏针对基因编辑过程中染色体结构异常发生机制的了解，领域内尚没有抑制该类副产物发生的有效策略。
虽然染色体结构异常在基因编辑过程中的发生概率仅百分之几，属于基因编辑中的小概率事件，然而随着基因编辑临床应用的不断普及，被编辑细胞出现不可控染色体易位等的病人的数量也必然会将逐渐增加。
最近美国FDA暂停了Allogene Therapeutics的临床CAR-T治疗，原因就是在病人体内发现了由基因编辑导致的可能引发癌症发生的染色体易位。
工欲善其事必先利其器
工欲善其事必先利其器，解决染色体结构异常的发生首先要有能够检测其发生模式的灵敏方法，在此基础上才能探索这些副产物的发生规律从而找到解决方案。
早在2019年，胡家志团队便首先开发了全面评估基因编辑安全性的方法PEM-seq（Primer-extension-mediated sequencing），可以从一个测序库中同时检测编辑活性、脱靶活性和染色体结构异常等信息。
在之前的工作中，该团队发现到染色体结构异常在细胞系中的发生频率最多可以达到10%左右；而与此同时染色体易位的发生也具有一定的随机性。
这些结果都说明了染色体结构异常是基因编辑过程中值得重视的副产物。
染色体易位存在于
多基因编辑的CAR-T细胞中
在本研究中，进一步利用PEM-seq评估了新一代CAR-T细胞制作过程中，发生染色体结构异常的情况。
新一代CAR-T的构建结合了基因编辑技术，在生产CAR-T细胞的同时敲除TRAC，B2M，PDCD1等多个基因，可以降低供体与受体之间的免疫排斥反应，实现异体移植的可能，并同时提高CAR-T细胞的杀伤能力。
PEM-seq分析表明染色体易位普遍发生于多个Cas9的靶向位点之间，其比例占到了总编辑事件的1%左右。
这意味着在CAR-T细胞疗法中，每次给病人回输108个CAR-T细胞便有多于106个细胞携带染色体易位。
而值得注意的是，以往关于淋巴瘤的研究表明，TRAC附近存在可以大幅促进基因表达的转录增强子，可以提升易位后附近原癌基因的表达水平。
这也在一定程度解释了为什么Allogene Therapeutics在CAR-T治疗中出现了异常增殖的细胞。
进一步该研究发现，目前领域内常用于消除脱靶活性的Cas9高保真变体并不能有效抑制Cas9靶向位点之间染色体易位的发生。
染色体易位普遍存在于新一代CAR-T细胞制作过程中
这让研究团队意识到，染色体易位是DNA双链断裂过程中的副产物，与脱靶活性无关。
反复切割导致
染色体易位大量产生
为了探究基因编辑过程中染色体易位发生的规律，该研究对PEM-seq数据进行了详细分析，意外发现了Cas9靶向位点与脱靶位点两端发生的易位连接存在着明显的偏好性，偏离了理论值1:1的比例。
通过这样一个“真奇怪”的发现（注：艾萨克阿西莫夫曾说，在科学探索中能听到的最激动人心、可能预示着新发现的一句话，不是“我找到了”，而是“真奇怪”），研究团队找到了基因编辑过程中染色体易位大量发生的主要原因之一——Cas9在靶位点和脱靶位点上的反复切割（repeated cleavage）。
Cas9反复切割完美修复产物导致了染色体易位的大幅度产生
即Cas9在体内每一次对靶向DNA位点进切割时，并不一定会产生期望的突变产物，实际上被切开的靶向位点有较大概率被体内修复系统完美修复，随后可以被Cas9再次切割。
反复切割靶向位点导致了DNA断裂末端暴露的时间延长，从而增加了染色体易位的发生风险。
开发Cas9TX
抑制反复降低染色体易位
反其道而行之，该研究尝试了核酸外切酶与Cas9相偶联的策略，希望通过在编辑过程中修饰DNA断裂末端来减少完美修复产物的比例，从而抑制Cas9反复切割。
通过对多种外切酶的筛选，该研究最终将人源的TREX2蛋白与Cas9相偶联生成核酸内外切酶Cas9X2。
PEM-seq分析显示Cas9X2确实可以抑制Cas9反复切割，并几乎消除了染色体易位的产生。
虽然TREX2蛋白在体内广泛表达并参与DNA复制与修复过程，但进一步地，为了防止引入过多TREX2导致基因组上的非特异性切割，我们将TREX2自身的DNA结合域突变，开发出了新型的Cas9TX编辑变体，并通过全基因测序等手段验证了Cas9TX并不会对基因组造成非特异性的切割。
与Cas9X2相同，Cas9TX可以稳定、有效地抑制消除染色体易位的产生，并达到了与造成DNA单链断裂的碱基编辑器同等的水平。
而分析发现Cas9TX还可以大幅度减少染色体大片段缺失的生成。
与此同时，在抑制染色质结构异常发生的同时，Cas9TX还能保持与Cas9同水平或者略高的基因编辑水平。
另值得指出的是，突变的TREX2仅236个氨基酸，不会显著增加Cas9的大小。
Cas9TX几乎消除了基因编辑过程中染色体易位的产生
与此同时，Cas9TX在使用方式上与传统Cas9没有区别，适用于体内体外各种编辑场景（核糖核蛋白RNP，AAV病毒包装等）。
利用Cas9TX消除CAR-T细胞
制作过程中染色体易位的产生
在经历了上述从发现异常到找到原理以及解决方案之后，研究团队进一步将Cas9TX应用于新一代CAR-T细胞的制作中，发现在不影响CAR-T杀伤效率的同时，Cas9TX将靶向位点之间的染色体易位降低到了背景水平。
而除了CART细胞制作这种ex vivo的基因编辑案例，该研究也将Cas9TX应用于in vivo眼部疾病模型年龄相关性黄斑变性（Age-related Macular Degeneration，AMD）的小鼠模型中，发现Cas9TX在消除染色体易位的同时，还可以极大抑制AAV载体的整合，与此相关的工作正在准备投稿中。
Cas9TX提高CAR-T细胞制作的安全性
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