同济大学等学者取得DNA测序技术的重要突破

众所周知，DNA是生物体的遗传密码。通常认为它们包括腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）四个碱基。后来的研究发现，DNA中还存在另外的碱基dU。这些碱基共同组成了DNA的基本元素。但是，迄今为止人类还难以从单个碱基分辨率水平上检测到dU。这构成了DNA序列检测的盲区和瓶颈之一，严重阻碍了对dU的功能的认知和对DNA遗传密码的理解。

从原核生物到真核生物，从单细胞生物到人类，除外A、T、G和C，它们的DNA中还包含着比例不等的dU。在艾滋病毒的DNA中，每二十个碱基就有一个以上的dU；而在疟原虫的DNA中，dU占碱基的比例大约为十万分之一。dU既能通过C碱基脱氨产生，又能“冒充”T碱基掺入到基因组中。由于缺乏敏感又特异的单碱基分辨率的dU测序技术，迄今为止人类并没有像其它碱基（A、T、G和C）那样实现dU在DNA中的精准定位。也就是说，现在的dU检测技术可以证实若干碱基中存在dU碱基，但是并不能确定dU碱基位于什么样的具体的碱基之间。dU碱基的生物学意义是什么？dU碱基在疾病发生发展中的意义又是什么？要回答这些问题，唯有取得单碱基分辨率水平上的dU碱基的检测和定位的突破，这是前提条件。

dU具有双面性，它有时充当人类健康的朋友，有时又可能是人类健康的敌人。许多报道发现，当机体面对不同抗原时，免疫细胞需要dU作为中间体，产生多种多样的抗体，帮助抵御诸如新冠病毒之类的病原体对人类的侵害。而当肿瘤或者心血管疾病患者体内出现dU时，则可能导致患者的基因组的不稳定，加速这些患者病情的发展。显然，精准检测dU在DNA中的分布情况，将有助于评估人类个体的生理学机能和疾病的预后。

然而，寻找DNA中dU的精确位置如同大海捞针，属于科学难题。我国学者经过多年的探索，最终发明了优越的单碱基分辨率的dU测序技术。该测序技术可以简要地叙述如下：首先研究人员找到一个合适“钩子”——一类耻垢分枝杆菌来源的名为UdgX的新型糖苷酶。UdgX能够将DNA的dU切除，形成一个缺口，并同时与对应的核糖形成共价键，最终将其捕获。作为“钩子”的UdgX “钓”到含dU的DNA片段后，还需要进一步确定dU位置。接下去，研究人员发挥DNA高保真聚合酶特性。这个酶就如同行驶在DNA轨道上的列车，当碰到被UdgX标记的dU的缺口时，会被动地原地“停车”。然后，研究人员结合高通量测序技术，将“停车”信号放大，最终在单个碱基的水平上精确地定位dU在DNA乃至基因组上的位置。以上介绍了单碱基分辨率的dU测序技术。研究人员进一步地概括了该技术，他们用一句话总结了该技术，这句话为：依靠UdgX并结合DNA高保真聚合酶的dU测序技术。为了便于该测序技术的传播和普及，他们将该技术命名为Ucaps-seq。从此，一个基于UdgX的在单碱基分辨率水平上的dU检测技术诞生了。基于该技术，今后可以像检测DNA中的A、T、G和C那样精确地检测DNA中的dU。

Ucaps-seq测序技术是国际上第一个酶法检测DNA中的dU碱基的技术，现存的dU测序技术均为化学法。酶法测序技术优于化学法测序技术。酶法测序技术的优点是：灵敏性好、特异性强和分辨率高。其他优点包括：效率高成本低，很少发生假阳性，也很少受到干扰因素的影响。例如，既有的DNA的dU化学测序技术需要先利用UNG酶切除dU成为无嘧啶的位点，而这样的处理较难与DNA自身存在的无嘧啶位点区分，不可避免地导致假阳性的发生，而Ucaps-seq测序技术则很少出现假阳性。再例如，Ucaps-seq测序技术可以排除其它碱基衍生物如5-羟甲基尿嘧啶的干扰。

研究人员利用该技术还做了进一步的验证和探索工作。他们首先在合成的DNA探针模型上验证了Ucaps-seq测序技术的原理，然后在诱变后的癌症细胞和B细胞中验证了Ucaps-seq测序技术的单碱基分辨率效能，最后还应用该技术对基因编辑脱靶进行了评估，发现Ucaps-seq测序技术对基因编辑脱靶具有强大的识别能力。

论文的通讯作者为中国科学院院士陈义汉教授（同济大学附属东方医院、同济大学医学院和同济大学心律失常教育部重点实验室）、马红辉研究员（同济大学附属东方医院和同济大学心律失常教育部重点实验室）和胡晋川研究员（复旦大学生物医学研究院和上海市第五人民医院）。论文的第一作者为江柳丹（同济大学博士研究生，导师为陈义汉院士和马红辉研究员）、尹家勇（复旦大学硕士研究生）和钱茂祥研究员（复旦大学生物医学研究院和复旦大学附属儿科医院）。