上午阅读了一篇Clin Chem Lab Med(CCLM)上刚上线的文章，颇有一番感触。
原文信息：Cavalier E: Long-term stability of 25-hydroxy vitamin D: importance of the analytical method and of the patient matrix. Clin Chem Lab Med. 2021.aop
https://www.degruyter.com/document/doi/10.1515/cclm-2021-0382/html
是的，你没有看错，作者就一个人：Etienne Cavalier。
在检验医学这片江湖上，Etienne Cavalier还是有很高的地位的。隔三差五就能在检验医学的主流杂志上看见他的名字。
这篇文章其实讲了一个十分简单的问题，就是维生素D的稳定性。简而言之，当血液标本在体外放置一段时间后，血清中维生素D是否会降解？或者说，如果一时半会儿测不了维生素D，能否将其放在冷藏条件下隔一段时间再测？
第一次看见文章标题的时候，我觉得文章的技术含量挺低的。按理说，CCLM是检验医学领域的榜眼级杂志，为何会刊登这篇看起来毫无技术含量的文章呢？怀着十分好奇的心情阅读完文章的第一段(文章没有摘要)之后，我才若有所思的意识到，这篇文章确实配得上CCLM，尽管实验设计和研究主题看起来没啥技术含量。
我们先来欣赏一下文章的第一段：
Twenty-five hydroxy vitamin D (25(OH)D) is known to be “solid as a rock” [1]. Lissner etal. [2] have showed that vitamin D metabolites in blood stored at 24 °C for upto 72 h remained intact. Other studies on the stability of 25(OH)D in plasma or serum that has undergone many freeze-thaw cycles have reported the same stability [3, 4]. Bruce Hollis has mentioned that he used the same pooled human 25(OH)D internal controls stored at −20 °C for 10 years with no detectable degradationof either compound (without showing any data) [5]. If other authors have presented stability results on long-term studies at −20 °C, but with a single method [6, 7], long-term storage studies at −80 °C including different methods and patients suffering from different diseases are however scarce. In this study, we evaluated the stability of serum 25(OH)D after 5 years of storage at −80 °C using three immuno-assays and a liquid chromatography coupled with 2 mass spectrometers in tandem (LCMS/MS) method in five different type of patients.
第一句话：维生素D坚如磐石。这句话开门见山，不玩虚的。有读者可能会问：为什么第一句话不是写“维生素D是一种什么物质，如何代谢，与哪些疾病有关”。诚然，如果文章研究的是维生素D的临床价值，那就可以这种套路开启论文，因为后续讨论研究的意义可能会涉及这些东西。但对于一篇研究维生素D稳定性的、读者群主要是检验科医生的文章，写这些东西纯属浪费版面。写文章三大忌讳中排名榜首的就是“天马行空，不着边际”。优秀的论文永远是“大道至简，不玩虚的”。
第二句话：Lissner这个人发现24度的情况下放九九八十一减去九个小时，维生素D仍然稳定，这就承接了第一句“solid as a rock”。
第三句话：介绍两项研究，说维生素D经过反复冻融还是很稳定的，继续承接“solid as a rock”。
第四句话：Bruce Hollis的研究显示，-20度的情况下，放个十年八年也问题不大。再承接“solid as a rock”。
第五句话：话风有些变了。还有两项研究也去探讨过-20度保存的情况下，维生素D还是否稳定，但是都只是用单个检测方法。这句话在暗示以往的研究有缺陷！这里需要说明一下，那个if我感觉应该是笔误，删除之后句子貌似更通顺一些。当然，这些微小的失误不影响文章的价值。
第二、三、四、五句话围绕一个稳定性问题层层推进(常温→反复冻融→-20度保存)，步步为营，环环相扣，最终引出本研究的创新性(单个分析方法)，可谓无懈可击，叹为观止。
第六句话：重点来了。以往的研究除了在只分析了一种检测方法以外，还有另一个问题，那就是没有人探讨过-80度条件下的长期稳定性。注意这句话：long-term storage studies at −80 °C including different methods and patients suffering from different diseases are however scarce。这篇文章的创新点在这句话中体现得一览无余：长期 (long-term) 稳定性、-80度、多种分析方法(different methods)、多种疾病(different diseases)。回过头来，我们再看标题：Long-term stability of 25-hydroxy vitamin D: importance of the analytical method and of the patient matrix。上述四大创新点中有三点已经出现在了标题中。当然，如果文章标题再写成Five-year stability of 25-hydroxy vitamin D at -80°C: importance of the analytical method and of the patient matrix，那就更好了。
第七句话：没啥可说的，相当于预告一下文章的主要内容，吊一吊读者的口味。
接下来，我们来看看文章的方法：2016年的时候，作者不知道在哪个犄角旮旯里找了一些病人，包括孕妇、慢性肾病、骨关节炎、透析患者和健康个体。当时，作者用四种方法(包含免疫法和质谱)检测了这些受试者的维生素D水平，并将剩余的血清冻到了-80度。
2021年2月，在经历了七七四十九天的念经诵佛、吃斋戒杀之后，作者把这些标本拿出来又测了一遍维生素D，以分析其是否稳定。
这就是所有的研究方法，简单得一塌糊涂，但绝非一地鸡毛。
接下来，我们来捋一捋文章的数据分析思路和主要发现。
如下图所示：四种分析方法中，有三种的结果居然是增高的，也就是说：这个维生素D放着放着还越放越高了，但Liaison这种方法测得的结果却是降低的。此外，质谱法的稳定性要稍微好点，变化也就5%左右。这说明，所谓稳定性，还和检测方法有关。需要说的是：作者稍微有点失误的地方是这张盒式图的上下两根横线到底是表示四分位间距还是95%可信区间，作者没在Figure legend中说，推测应该是后者。此外，Y轴没有进行标识，但按照常理能推测出应该是变化幅度。
紧接着，作者又进行了亚组分析，也就是分析下维生素D这个东西，是不是在各种疾病中都是一样稳定的，形成了下面这张图：
总体来看，维生素D的稳定性还是与疾病状态有关，也就是标题中说的patient matrix。从这张图我们可以看出，稳定性确实受疾病状态的影响，比如在Lumipulse这种检测方法中，慢性肾病和孕妇的维生素D增高幅度就比较大，说明维生素D在这两种人群中的稳定性明显不如关节炎、透析患者和健康个体。其余不再一一赘述。
需要说明的是，从上面两张图我们可以看出，两次变化幅度的95%可信区间与100%之间并不重叠，说明这些变化是有统计学意义的。换而言之，从统计学上可以认为维生素D在-80度条件下保存五年并不稳定。但统计学最终还是回归专业解释：统计学上有意义，并不意味着专业上有意义！就这篇文章而言，变化幅度虽然有统计学意义，但最多也就25%，到底有没有专业意义呢？不好说！注意结论中的那句话：In conclusion, our results show that the variation of 25(OH)D concentrations after 5 years of storage at −80 °C is small, but statistically significant。这个small到底有没有专业价值呢？作者没有下结论，也无法下，这毕竟是个见仁见智的问题。众所周知，一个生物标志物的变异来源于多方面：比如生物变异、仪器的精密度等。即便我们拿着新鲜标本连续测20次，也不可能100%没有偏差，但偏差是否能达到25%，这个就不好说了。如果作者再做一个精密度和生物变异，文章就更完美了。当然，没有绝对完美的研究，只有相对完美的研究。
当然，文章还有个重要的结论就是：质谱法是相对稳定的，免疫法的稳定性要差点。
我们回头来反思，这篇文章为什么能登上CCLM这种白富美级别的杂志。胡某认为除了写得好，设计得正确以外，还有两点原因：
第一、有四大创新点：长期稳定性、-80度、多种分析方法、多种疾病，这是以前的研究不曾涉足的。尤其是长期稳定性，这个不是一时半会儿能做出来的。作者为此等待了五年！五年前作者就想到了做这个研究，可见做科研要学会打提前量，眼光要超前。看得见的范围叫视线所及，看不见却能想到的东西才能叫视野所及。
第二、文章有其现实意义。有读者可能会问：谁会犯傻等五年才测维生素D，常规检测最多等上三天就了不起了。此言差矣！常规检测确实不需要等很久，但如果是科研呢？那就得等很长的时间了。比如有人现在想用既往的队列和血清标本研究研究维生素D是否是阿尔茨海默病的危险因子，那拿出来检测维生素D的标本多是十年、甚至二十年前冻存的，此时检测的维生素D结果还靠谱不靠谱那就很难说了。如果我们不把维生素D的长期稳定性弄清楚，那就无法确定这些队列研究结果的可靠性以及可推广范围。
这篇文章回答了一个维生素D体外稳定性问题，看似十分简单，但再简单的问题也必须实证化，这是医学的要义所在。医学终究还是一门自然科学，顶多在前面再加个形容词：要考虑人文和社会因素的自然科学。自然科学必须建立在客观数据或证据的基础上，任何主观看法在客观数据面前都是不堪一击。
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