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微生物前沿|荧光Cy5DNA扩增及酶切产物分离–检测

汉斯出版社

2023-01-16

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导读：

dNTPs加入一定比例Cy5-dATP可以扩增荧光Cy5DNA，用于T5外切酶(T5exo)类DNA酶检测，关键是酶切产物分离–检测。[方法]本研究以1/1000 Cy5-dATP的dNTPs扩增5851 bp荧光Cy5DNA pET28a-xyn。基于纯化柱吸附DNA原理，首先确定2倍P3缓冲液(2×P3)为纯化柱吸附DNA最小用量，进而用纯化柱以2×P3分离Cy5DNA溶液、等量Cy5DNA经T5exo酶切反应液(Cy5DNA-T5exo)，分别得到洗脱液(含有Cy5DNA)和滤出液(含有酶切产物Cy5-dATP)。[结果]酶标仪定量检测显示，含120 ng Cy5DNA洗脱液荧光值5824、滤出液0。含120 ng Cy5DNA-T5exo滤出液荧光值7573、洗脱液0。激光共聚焦显微镜定性检测显示，Cy5DNA洗脱液有荧光、滤出液无。Cy5DNA-T5exo滤出液有荧光、洗脱液无。定量和定性检测结果与纯化柱吸附DNA、滤出酶切产物原理和功能相同。进而分析了Cy5DNA浓度、Cy5-dATP浓度与荧光值的定量关系。[结论]荧光Cy5DNA成功扩增，其酶切产物经纯化柱以2×P3成功分离，为荧光DNA扩增和用于DNA酶活性检测奠定了基础。

基本信息：

荧光Cy5DNA扩增及酶切产物分离–检测

Amplification of Fluorescent Cy5DNA and Separation-Detection of Digestion Product

作者：

郑园霞, 张毅, 李雪刚：河南农业大学，生命科学学院，河南郑州；刘亮伟：河南农业大学，生命科学学院，河南郑州；农业部农业酶工程重点实验室，河南郑州

关键词:

荧光DNA扩增；酶切产物；纯化柱分离；荧光检测；Fluorescent Cy5dna Amplification；Digestion Product；Column Separation；Fluorescence Detection

项目基金：

国家自然科学基金：基于同源/非同源结构置换的木聚糖酶–葡聚糖酶结构元件功能解析(31771915)

原文链接：

https://www.hanspub.org/journal/PaperInformation.aspx?paperID=59936

内容简介：

在汉斯出版社《微生物前沿》这本期刊中，有论文以加入1/1000 Cy5-dATP的dNTPs扩增5851 bp荧光Cy5DNA pET28a-xyn (xyn为黑曲酶GH11木聚酶基因)，用于T5 DNA外切酶(T5exo)酶切反应。首先探讨纯化柱截留DNA所需P3缓冲液的最小用量，进而分离Cy5DNA溶液、Cy5DNA-T5exo反应液，分别得到洗脱液(含有Cy5DNA)和滤出液(含有酶切产物Cy5-dATP)，通过酶标仪、激光共聚焦显微镜定量、定性检测，为荧光Cy5DNA扩增、用于DNA酶学性质研究奠定基础。

研究发现与DNA纯化柱不同，蛋白浓缩的超滤管(3 kDa和100 kDa)不能分离Cy5DNA-T5exo酶切产物，可能蛋白浓缩时不考虑小分子物质是否滤出或吸附膜上。另外，纯化柱吸附200 bp以下DNA效率较低 [20]，如果酶切产物小于200 bp，需要通过聚丙烯酰氨凝胶检测，垂直电泳提供聚丙烯酰氨的无氧环境。荧光Cy5DNA在酶学性质研究中特异性更高，但是每个样品都需要纯化柱分离荧光Cy5DNA，探讨更方便的分离方法也是荧光Cy5DNA研究的发展方向。

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2.王煦, 徐成功, 王敬峰, 王玉. 基于滚环扩增技术耦合切刻内切酶信号放大技术的新型超灵敏miRNA-122荧光传感器[J]. 传感器技术与应用, 2017, 5(4): 53-62.

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3.刘燕, 李俊超, 乔青青, 卫润鑫, 薄尤优, 王昇, 陈莎莎. 反相高效液相色谱–荧光检测法测定面粉、淀粉中10种二苯乙烯类阴离子型荧光增白剂[J]. 食品与营养科学, 2019, 8(4): 273-284.

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所属期刊

-Advances in Microbiology-

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