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微生物前沿|褐藻胶降解菌突变株的选育及降解特性研究

汉斯出版社

2025-04-01

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导读：

【目的】通过双重诱变获得高效降解褐藻胶的菌株，并确定该菌株发酵产酶的最优条件，同时研究其化学试剂抗性能力、降解效率，进而解析该菌株的降解特性。【方法】采用紫外和亚硝基胍(NTG)溶液对原始菌株Cobetia sp. cqz5-12进行双重诱变，利用平板初筛(氯化钙透明圈法)和摇瓶复筛(二硝基水杨酸法(DNS法))获得目的突变菌株。采用单因素试验优化其发酵条件，分别利用滤纸片法和氯化钙透明圈法分析化学试剂对菌株生长和降解褐藻胶能力的影响，利用间苯三酚分光光度计法测定菌株发酵液对不同底物的降解效率。【结果】筛选得到一株降解效率显著提高的诱变菌株，并将其命名为Cobeita sp. cqz5-12-M2。该诱变菌株最优发酵条件为pH 6.5、NaCl浓度为0、发酵温度为31℃、发酵时间为96 h，此时该突变株总酶活可以达到59.81 U/mL，比原始菌株的酶活提高50.84%。该突变菌株对褐藻胶的降解效率为42%，比原始菌株提高8.8%。该突变菌株和原始菌株均对多种待测试剂有敏感性。突变使得菌株对苯酚、氯霉素、阿莫西林或氨苄青霉素的敏感性降低，对过氧化氢、乙醇、碘伏等多种化学试剂的敏感性增强。当培养基中存在链霉素、氨苄青霉素或卡那霉素存在时，突变使得菌株对褐藻胶降解能力减弱，当培养基中存在阿莫西林、5%石炭酸、庆大霉素或头孢菌素时，突变使得菌株对褐藻胶降解能力增强。【结论】筛选得到的突变菌株对多种消毒剂和抗生素具有良好抗性，对环境耐受性强，是目前少见的高适应性褐藻胶降解菌。

基本信息：

褐藻胶降解菌突变株的选育及降解特性研究

Study on Breeding and Degradation Characteristics of Algin Degrading Mutant Strains

作者：

王蒋媚, 蒋人凤, 祝婕, 陈琼珍*：温州大学生命与环境科学学院，浙江温州

关键词:

褐藻胶降解菌；诱变选育；降解特性

项目基金：

微生物菌群与多花黄精主要有效成分含量相关性及多糖发酵中的作用研究(横向课题2021110099HX)

浙江省自然科学基金青年基金项目(LQ18C010004)

国家自然科学基金青年科学基金项目(31800094)

原文链接：

https://doi.org/10.12677/amb.2025.141005

内容简介：

在汉斯出版社《微生物前沿》期刊上，有论文为提高已分离的褐藻胶降解菌的褐藻胶降解能力，利用NTG和紫外对褐藻胶降解菌株Cobetia sp. cqz5-12进行双重诱变。

培养基LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化钠10 g，pH7.5。种子液培养基(g/L)：海藻酸钠6 g，胰蛋白胨5 g，酵母粉2.5 g，氯化钠25 g，磷酸氢二钾0.25 g，七水硫酸镁0.5 g，硫酸亚铁·七水0.05 g；固体培养基在种子液培养基的基础上添加2%的琼脂。发酵液培养基(g/L)：海藻酸钠5 g，胰蛋白胨5 g，氯化钠25 g，磷酸氢二钾0.25 g，硫酸镁·七水0.5 g，硫酸亚铁·七水0.05 g。发酵优化培养基(g/L)：酵母粉5 g，海藻酸钠5 g，氯化钠X g，磷酸氢二钾0.25 g，硫酸镁·七水0.5 g，硫酸亚铁·七水0.05 g，pH X。亚硝基胍母液：将10 mg NTG溶于1 mL丙酮，配制成10 mg/mL的亚硝基胍母液。化学试剂：化学试剂包括消毒剂和抗生素，消毒剂为2%苯酚、75%乙醇、5%石炭酸、碘伏和3%过氧化氢，抗生素为50 ug/mL卡那霉素、50 ug/mL庆大霉素、100 ug/mL氨苄青霉素、50 ug/mL氯霉素、10 mg/mL四环素、300 ug/mL头孢菌素、50 mg/mL链霉素、20 ug/mL阿莫西林、10 mg/mL利福平和0.05 ug/mL异烟肼。

设置不同诱变时间：将亚硝基胍母液分别加入到5支含有10 mL菌悬液的试管中，使亚硝基胍终浓度为0.001 g/L。将5支试管置于37℃恒温水浴锅内分别温育0、10、20、30、40 min，温育过后的每支试管里的菌悬液平铺至数个无菌的空培养皿内，并置于20 W紫外灯下分别照射0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 min (照射距离为45 cm)。紫外照射结束后，迅速在黑暗条件下将各个培养皿中的菌悬液以5000 r/min离心3 min以收集菌体沉淀。用适量的无菌生理盐水洗涤菌体两次，然后用同样的生理盐水梯度稀释至合适梯度，取100 uL菌悬液涂布于含0.6%海藻酸钠的种子培养基平板上，30℃倒置培养24~48 h进行菌落计数，计算致死率。

设置不同诱变浓度：取10 mL菌悬液平铺于无菌空培养皿内，于20 W紫外灯下照射2 min (照射距离为45 cm)。之后于黑暗条件下迅速5000 r/min离心5 min收集菌体沉淀，用适量的无菌生理盐水洗涤菌体两次，然后用相同体积的生理盐水重悬菌体沉淀，制得的菌悬液均分成5等份后加入适量NTG溶液使NTG终浓度分别为0、0.01、0.001、0.0001、0.00001 g/L。将处理过的菌悬液于37℃恒温水浴锅内温育20 min，5000 r/min离心5 min收集菌体沉淀，用适量的无菌生理盐水洗涤菌体两次，然后用同样的生理盐水梯度稀释至合适梯度，取100 uL菌悬液涂布于含0.6%海藻酸钠的种子培养基平板上，30℃倒置培养24~48 h进行菌落计数，计算致死率。

以发酵液培养基为出发培养基，对培养基组分及培养条件进行优化，包括NaCl浓度、最适pH值、最适温度和发酵时间。除考察发酵时间因素外，其余条件的发酵时间均为72 h将培养得到的Cobetia sp. cqz5-12-M2种子液离心收集、洗涤后按5%接种量分别接种至相应发酵液体培养基中，150 r/min，30℃进行培养，培养结束后，4℃、8000 r/min、5 min离心，分别收集发酵上清液和菌体沉淀，利用DNS法分别测定发酵上清液和菌体沉淀酶活。以上述得到的最优发酵条件分别发酵培养原始菌株和突变菌株。培养结束后收集上清液和菌体沉淀测酶活，以比较原始菌株和突变菌株在最优发酵条件下的总酶活差异。

利用氯化钙浸润法对经过NTG和紫外诱变后的菌株进行初筛，从中选取六株菌株。对原始菌株和该6株突变菌株再次进行氯化钙浸润法初筛和DNS复筛，数据结果见表1。与原始菌株相比，这三株突变菌株降解能力无显著性差异。

突变菌株Cobeita sp. cqz5-12-M2降解条件优化结果如图1，最终确定了突变菌株的最优发酵条件NaCl浓度为0%，pH为6.5，在31℃下培养为96 h。

结论

本研究通过紫外和NTG双重诱变，获得一株突菌变株Cobetia sp. cqz5-12-M2，此菌株比原始菌株的酶活提高50.84%，对褐藻胶的降解效率为42%。与原始菌株相比，该菌株在阿莫西林、5%石炭酸、庆大霉素或头孢菌素中的褐藻胶降解能力增强。在当前抗生素滥用且环境中抗生素有残留的情况下该菌株的这种突变特性使其具有一定的应用优势。

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https://doi.org/10.12677/HJFNS.2018.71004

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https://doi.org/10.12677/ms.2024.1410161

所属期刊

-Advances in Microbiology-

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