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仪器与设备|免疫印迹分析仪校准方法探讨

汉斯出版社

2025-09-04

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导读：

针对免疫印迹分析仪的校准方法展开探讨，通过与已有免疫原理的体外诊断仪器比较，论证了开展校准方法的必要性。通过分析仪器的结构和工作原理，提出了校准所需的环境条件和设备要求，重点研究了全自动和半自动免疫印迹分析仪的计量特性、校准条件及校准方法，并详细阐述了进样体积示值误差、重复性以及泵流量稳定性等关键校准项目的实施步骤。研究旨在当前缺乏国家计量技术规范的情况下提供校准指导指南，为仪器的计量溯源提供技术参考，确保检测结果的准确性和可比性。

基本信息：

免疫印迹分析仪校准方法探讨

Exploration of Calibration Method for Immunoblot Analyzer

作者：

黄彦捷*, 赖贵琦, 郑智杰, 吴明凯：广东省计量科学研究院，广东广州；熊文峰, 张吉：深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司，广东深圳

关键词:

免疫印迹；校准；计量

项目基金：

广东省省级科技计划项目(2023A1111120024)

广东省市场监督管理局科技项目(2024ZZ03、2025ZJ01)

国家市场监督管理总局科技计划项目(2022MK093)

原文链接：

https://doi.org/10.12677/iae.2025.133044

内容简介：

在汉斯出版社《仪器与设备》期刊上，有论文探讨全自动免疫印迹分析仪校准方法。

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方法比较与校准条件

免疫印迹分析仪的原理、结构、结果判读方式及应用领域均有较大差异，如表1所示。免疫印迹分析仪的计量特性考察指标如表2。

环境条件

校准的环境温度范围为(15~30)℃；湿度要求小于等于85% RH。室内应具备良好的防尘措施，为防止干扰，仪器应远离振动、电磁干扰。

设备条件

校准使用的标准物质应是经国家计量行政部门批准颁布的具有互换性的IgE抗体标准物质(户尘螨、蒿属花粉免疫球蛋白E等)，扩展不确定度不大于20%，k = 2。由于免疫分析存在基质效应，校准示值误差时不建议将有证标准物质稀释使用，否则可能影响互换性。

校准过程中所使用的电子天平的分度值应为0.01 mg，准确度等级为①级；温度计及温度测量仪的最大允许误差不超过0.1℃；秒表的最小分度值不大于0.1 s；标准灰度卡应不少于5个灰度，且反射比ρ测量结果范围均匀分布在0.121~0.778，Ur ≤ 1.0% (k = 2)。

校准项目、方法与不确定度评定

1. 进样体积的相对示值误差和进样体积的重复性

根据设定体积对应的实验温度下纯水的质量，换算为进样体积，计算示值误差及重复性。将可密封容器在分度值为0.01 mg的电子天平上称量质量，去盖后放到分析仪板架的合适位置，控制样品针往该容器中加入10 μL平衡至室温的脱气纯水，立即盖上容器在电子天平上称量质量。根据公式(1)计算加液体积，重复测量6次，根据公式(2)计算加液体积重复性。取后3次测量结果根据公式(3)计算10 μL校准点的加液体积示值误差。重复上述过程，加液体积改为1000 μL，计算1000 μL校准点的加液体积示值误差。每一根加液针都按上述方法进行校准，并分别报告结果。

式中：V——加液体积，μL；m——容器和纯水的总质量，mg；m0——容器质量，mg；ρt——实验温度下水的密度，g/cm3。

式中：Rv——加液体积重复性，%；V¯¯——6次加液体积测量结果平均值，μL；n——测量次数，n=6。

式中：V0——体积设定值，μL；Vi——第i次加液体积测量结果，μL；Ev——加液体积相对示值误差，%。

2. 泵流量设定值允许误差及稳定性

按要求设定流量，启动仪器，压力稳定后，在流动相出口处用事先称重过的洁净容量瓶收集流动相，同时用秒表计时，收集规定时间流出的流动相，在分析天平上称重，按公式(4)计算流量实测值Fm按公式(5)、公式(6)计算Ss和SR。每一设定流量，重复测量3次。

式中：Fm——流量实测值，mL/min；m——容器和纯水的总质量，g；m0——容器质量，g；ρt——实验温度下水的密度，g/cm3；t——收集流动相的时间，min。

式中：Ss——泵流量设定值相对误差，%；F¯¯m——同一设定流量3次测量值的算术平均值，mL/min；Fs——流量设定值，mL/min。

式中：SR——泵流量稳定性，%；Fmax——同一设定流量3次测量值的最大值，mL/min；Fmin——同一设定流量3次测量值的最小值，mL/min。

3. 检测器分辨率

将分辨率测试标准图卡置于拍摄腔内拍摄成像，直接保存成像结果，通过软件读出分辨率。

4. 检测器重复性

选取中间反射比值的标准灰阶卡，将标准灰阶卡放置在检测模块上，直接使用分析仪测定此时的测量值xi，重复测定6次，记录仪器示值，并计算平均值，按公式(7)计算相对实验标准偏差，作为分析仪的重复性结果。

式中：xi——标准灰阶卡第i次测量值；x——标准灰阶卡强度平均值；n——重复测量次数，n = 6；sr——检测器重复性，%。

5. 检测器线性

在低值至高值范围内，对至少5个反射比值的标准灰阶卡进行测量，重复测量3次，取均值作为测量值，各被分析项目均得到一组不同浓度的测量值(yi)。在各被分析项目不同浓度的测量值(yi)和其对应的不同浓度的标准值(xi)之间，按公式(8)计算线性相关系数(r)作为线性的表征。

式中：r——线性相关系数；xi——各标准灰阶卡的标准值；x¯——各标准灰阶卡标准反射比值的平均值；yi——各标准灰阶卡的测量值；y¯——各标准灰阶卡的测量值的平均值；n——被分析各标准灰阶卡的个数。

6. 温度示值误差

将分析仪温度设置为37.0℃或仪器常用反应温度，把温度计或温度测量仪的传感器放置在反应模块上，平衡30 min待读数稳定后，根据公式(9)分别计算并报告上述代表性孔位的孵育温度示值误差。

式中：T0——孵育温度设定值，℃；Ti——第i次温度测量结果，℃；ET——孵育温度示值误差，%。

7. 临床项目示值误差

分别测量选定检测项目的校准点，每个校准点分别重复测量3次，计算3次测量结果的平均值。根据公式(9)计算示值误差：

式中：Δc——示值误差；c¯——3次测量结果的平均值；cs——标准值。注：单位与标准物质标准值的单位一致。

8. 不确定度评定

以临床项目示值误差为例，不确定度来源包括：免疫印记分析仪测量重复性引入的标准不确定度u(c¯) 及标准物质引入的标准不确定度u(cs) 。下面以一次免疫印记分析仪校准为例具体分析其测量不确定度，在校准中选用GBW(E)090941户尘螨特异性IgE抗体血清(液体)标准物质，其标准值为(28.4 ± 5.4) IU/mL (k = 2)。

对该标准物质连续测定10次测定的结果分别为(单位：IU/mL)：30.4、30.6、31.9、32.3、29.5、31.0、29.4、31.2、30.4和29.5，则单次测量结果的标准偏差为：