奶牛场荧光定量PCR检测实验室建设实践与思考
——以原生态牧业奶牛场实验室建设为例
荧光定量PCR技术用于病原微生物基因表达、基因组变异和多态性检测等，具有灵敏度高、特异性高、快捷、对样品要求低等优点，已广泛用于临床诊断和畜禽疫病诊断。本文以黑龙江原生态牧业奶牛场荧光定量PCR检测实验室建设为例，从设计规划、配套设备、人员配备、环境控制及存在问题解决五大方面进行论述，提出PCR实验室建设要根据奶牛场场地实际情况，规划适合PCR实验检测区域；根据PCR检测需求及奶牛场费用预算配置实验设备；根据奶牛场预计检测样品量配备检测人员及培养储备人员；在建立严格的操作规范基础上，严格执行实验分区管理及检测过程中消毒流程，避免实验过程中产生气溶胶污染环境。
聚合酶链反应（PCR）广泛用于疾病诊断[1]。实时荧光定量PCR技术实现PCR从定性到定量检测的飞跃，所有反应均在同一溶液进行，不需任何后处理过程，具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高、定量结果准确和重现性好等特点[2]，已广泛应用到动植物基因工程、微生物和医学领域，涉及范围包括DNA、mRNA和病毒荷载量的定量、核酸多态性、基因突变分析等[3]。
近年来畜禽类疫病诊断常借助此方法进行筛查。农业农村部下发关于非洲猪瘟检测工作通知，特别是中华人民共和国农业农村部第119号公告，更加快了PCR检测方法的推广。目前荧光定量PCR已用于寄生虫的检测和鉴别。罗文等[4]应用荧光定量PCR及ELISA法检测弓形虫感染，发现荧光定量PCR在诊断和鉴别中有独特优势。刘世国等[5]采用荧光定量PCR动态观察感染弓形虫的家兔血液中的虫体。另外毛圆线虫、微小隐孢子虫、螺旋体和立克次氏体的荧光定量PCR检测法也有报道[3]。在奶牛场疫病筛查方面，虽然没有相关文件明确要求企业开展PCR实验室检测，但随着牛疫病类部分进口ELISA试剂盒进口中国受限，相同检测项目的商品化生产PCR试剂盒的出现，无疑推动了规模化奶牛场运用PCR方法，进行牛病毒性腹泻病毒、乳房炎等疾病的检测，促进了奶牛场PCR实验室的建设。
PCR实验室检测过程中，很多操作会产生气溶胶，如离心、混匀等。为保证环境安全，PCR实验室建设需要独立区域，避免与其余环境交叉混杂[6]。实验室平面应满足《GB19489实验室生物安全通用要求》，设计需考虑布局，空调通风系统设计、气流控制等以避免环境污染[7]。
实验室分区要根据奶牛场场地实际情况，选出适合PCR检测的地方进行规划，一般分3个独立的实验区：试剂准备区、样品制备区、扩增分析区。每个实验区都是独立房间，不同区与区之间有传递窗，共用一条长走廊。每个实验区有缓冲区，前后各一道门，可设计互动连锁，一个门打开，另一个门关闭。各实验区门上须有一个可视窗。进入实验室操作呈单一方向，须遵守：PCR实验室门→走廊→外门→缓冲区→内门→实验区内。3个实验区的走向应遵循单向原则：试剂准备区→标本准备区→扩增分析区，严禁逆向进入各区，避免交叉污染[8]。3个实验室区配备专用实验设备、耗材、清洁用品、专用实验服（有明显的区分标识，试剂准备区-白色，样品制备区-绿色，扩增分析区-蓝色）。PCR实验室试剂准备区为正压。扩增分析区，为避免气溶胶漏出，为负压。同时为避免气溶胶污染，应尽量减少在本区的不必要走动（图1）。
2.1试剂准备区
试剂准备区主要进行试剂贮存、试剂分装和主反应混合样的制备，主要设备有超净工作台、冰箱（具 有冷藏和冷冻双功能）、瞬时离心机、漩涡震荡仪、移液器（10μL、50μL、200μL、1000μL）、温湿度表等。
2.2样品制备区
样品制备区主要进行样品的保存、核酸提取和样品的分装、加样离心等。主要设备有生物安全柜、冰箱、高速离心机、漩涡震荡仪、恒温培养箱、水浴锅或金属浴、可移动紫外消毒灯、移液器（10μL、50μL、200μL、1000 μL）、温湿度表等。
2.3扩增分析区
扩增分析区为核酸扩增和对扩增的产物进行分析。主要仪器设备有生物安全柜、荧光PCR分析仪（BMS Mic-4）、电脑（DELL）、可移动紫外消毒灯、瞬时离心机、移液器（10μL、50μL、200μL、1 000μL）、温湿度表等。
PCR实验室建设除实验室区域的严格划分和合理的仪器设备配置，人员培训是关键环节。在建立严格的操作规范基础上，根据预计检测量配置人员。人员选择需重点考察细心和稳重，岗前需经过专业部门技术人员系统培训，理论培训学习和实践操作考评合格后方能上岗，上岗后因初期检测流程需梳理，人员操作技术需强化，检测样品量不应过多。熟悉流程后，再进行大批量检测。每个PCR实验室除专门负责做实验人员外，还要有1～2个储备学习人员，以备临时性人员不足或样品量增加时，可快速上岗。储备人员需在老员工指导下实验，熟记操作规程，严格按照操作规范独立操作。实验室人员要定期进行多种实验比对，保证检测结果准确。
为确保外界空气不受污染，除独立排风管道和独立通风系统外，进出实验区应做到人、物分离。
不同实验区之间用传递窗进行物品传递，避免交叉污染。不同实验室区配备专用的物品如实验服、手套、鞋套、帽子、口罩、消毒用品、垃圾桶、拖把等，摆放有序，用不同颜色标签区分。不同试验区的移液器、枪头、EP管、EP管架等不能混用。因黑龙江地区冬季寒冷，还需考虑恒温，地热取暖的牧场应控制温度不宜过高，暖气取暖的牧场应控制温度达25℃左右，不宜过低。
开始实验前，用84消毒液（有效氯浓度为0.2%）消毒实验室，同时生物安全柜和实验室紫外设备开启，灭菌30min。关闭紫外设备，通风30min后进入实验室。实验结束后，用核酸降解试剂处理生物安全柜和台面，静止5min后，用无尘纸擦掉，再用酒精擦拭两遍。用酒精棉球擦拭所用器具（如移液枪、枪头盒、镊子、架子、废液桶、离心机、水浴锅、金属浴、培养箱等），打开紫外线灯照射30min以上。用酒精棉球或84消毒液将所触碰地方（冰箱、生物安全柜开关、生物安全柜门扶手、传递窗、门把手）进行消毒。地面用84消毒液消毒。全部结束后，打开移动紫外线灯，照射室内30min以上。实验结束后，垃圾废弃物处理办法：先用84消毒液浸泡，固体垃圾用垃圾袋密封，84消毒液浸泡的枪头及废弃物直接放入垃圾袋密封好，表面喷洒84消毒液；上机后的PCR反应管，放在84消毒液的密封瓶中；手套、口罩、帽子、鞋套表面喷洒84消毒液集中处理；样品放置板，放于84消毒液中浸泡30min。
5.1PCR实验室建设过程中问题解决
在PCR实验室建设过程中，应注意实验室分区的合理性。每个实验室分区的面积，要根据奶牛场环境条件和样品检测量设定。因冬季黑龙江地区较寒冷，还需考虑实验室温湿度恒定，防止过热或者过冷。荧光PCR分析仪采购，要选择检测灵敏度高，能防止样品之间气溶胶污染的设备。仪器技术支持人员业务要熟练，能够24h响应，解决技术问题。试剂前处理时所用的水浴锅或金属浴，可根据奶牛场一次检测的样品量选购一种即可。
5.2开展PCR实验时问题解决
PCR检测灵敏度高，开展PCR实验时，要注意样品采集规范性，现场采样人员要严格按照样品采集流程，严格执行消毒流程，避免样品交叉污染，还应注意采集的样品量的要求，避免样品提取液的不必要浪费。
在实验过程中，用水浴锅前处理样品时，需打开中间气孔，加水量不宜过多，防止样品管处理过程中崩盖，避免气溶胶产生。如果崩盖，记录下崩盖的牛号，注意其周围牛号。如果发生崩盖爆管，要及时更换水浴锅的水。在使用水漂时，样品管上下均需预留空间。恒温培养箱应放温度计实测，样品放置时要避开排风口和最底层加热板，防止受热不均。
生物安全柜正确使用流程：
实验前：打开电源开关→将安全门拉至安全线→将用具放入生物安全柜内→酒精擦拭→拉下安全门→打开紫外线灯，照射灭菌30min后→将安全门拉至安全线→打开排风按钮（15min），方可检测。
实验中：排风全程开启。生物安全柜使用时，划分3个区域进行物品摆放，排风孔不能遮挡。如果在检测时液体飞溅至操作台面，用无菌棉布沾取84消毒液覆盖，不要大面积擦拭，防止气溶胶扩散，造成核酸大面积污染。待整体操作完成后，再进行消毒，多进行几遍。若有阳性结果出现，也要多次消毒。单人操作时，操作人员尽量坐在生物安全柜中间区域；左边为净区，放置枪头盒；中间为操作区（半污染区），放置枪架、移液枪；右侧为污染区，放置盛装84消毒液的废弃桶，用于装使用后的移液枪枪头。
实验后：将用具进行酒精消毒，操作台面用核酸降解试剂先消毒，作用5min，擦拭干净后，再用酒精喷洒擦拭2遍；紫外杀菌30min。实验结束时，要严格按照消毒流程，防止污染；实验室要定期环境监测，一旦出现污染，要反复多次消毒，防止扩散，确保PCR实验室安全有效运转。
5.3“假阴性”结果原因查找
5.3.1 观察扩增产物位置和加样情况
取扩增产物时，观察管是否放对位置，该孔位PCR管的液面是否略低于其他孔，排除放管错误和加样异常导致的结果。
5.3.2 样品5倍稀释重新复测
如果排除5.3.1的原因，可将样品核酸做5倍稀释复测，排除抑制剂干扰。
5.3.3 分析内参数值，排查采样规范性
如果稀释后内参没有，或者“假阴性”结果占比较多，建议排查采样环节。
PCR实验室生物安全防护、操作规范、环境控制管理等，相对普通实验室更严，应从实验室设计、设备配套、人员培训等进行可行性评估。黑龙江寒冷地带的奶牛场，PCR实验室短期投入较高，但长远看，能提供强有力技术支撑，节省费用，早筛查早处理，避免牛只传染性疾病传播带来的经济损失。
作者：刘彩娟，王永信，任 亮
参考文献
[1] 王秀丽，徐振兴.浅谈临床定量PCR实验室的质量控制[J].中 国医药指南，2016，14（35）：297-298.
[2]Ke L D，Chen Z，Yung W K.A reliability test of standard- based quantitative PCR：Exogenous vs endogenous standards[J].Mol Cell Probes，2000，14（2）：127-135．
[3] 黄小红，丁黄洁，瞿明仁.荧光定量 PCR 技术及其在畜牧兽 医中的应用[J].广东畜牧兽医科技，2007，32（4）：9-12.
[4] 罗文，余世瑢，胡千里，等.应用荧光定量PCR及ELISA法 检测弓形虫感染分析[J].中国优生与遗传杂志，2002，10
（1）：31.
[5] 刘世国，秦川，姚志军，等.弓形虫感染家兔血液中虫体的 动态观察[J].中国人畜共患病学报，2006，22（8）：759- 760.
[6] 卫芳，王艳婷，赵静雪，等.微生物实验室的风险评估及风 险控制措施[J].食品安全导刊，2021（14）：28-29.
[7] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准 化管理委员会发布单位GB19489-2008 实验室生物安全通 用要求 [S].
[8] 王海玉，沈剑.实验室规划设计与建设要求[A].中国医学装备 大会暨 医学装备展览会论文汇编[C]，2021.
