cfDNA提取建库
写在前面的
最近看完与cfDNA相关的文献后我一直有一个疑问，关于cfDNA的高通量测序数据，如何确保数据分析中筛选出的DNA序列是cfDNA序列（Extracellular DNA）而非细胞内DNA（Intracellular DNA）？因为在普通健康人群中cfDNA含量极低，大部分人体中每毫升血浆cfDNA含量不超过25ng。由于还没有正式开展相关研究，有必要提前了解相关信息以回答心中的这个疑问。
去除Intracellular DNA
我查阅了多篇方法部分涉及到cfDNA NGS数据分析的文献：
Ganesamoorthy D, Robertson AJ, Chen W, Hall MB, Cao MD, Ferguson K, Lakhani SR, Nones K, Simpson PT, Coin LJM. Whole genome deep sequencing analysis of cell-free DNA in samples with low tumour content. BMC Cancer. 2022 Jan 20;22(1):85. doi: 10.1186/s12885-021-09160-1. PMID: 35057759; PMCID: PMC8772083.
Palmieri M, Baldassarri M, Fava F, Fabbiani A, Gelli E, Tita R, Torre P, Petrioli R, Hadijstilianou T, Galimberti D, Cinotti E, Bengala C, Mandalà M, Piu P, Miano ST, Martellucci I, Vannini A, Pinto AM, Mencarelli MA, Marsili S, Renieri A, Frullanti E. Two-point-NGS analysis of cancer genes in cell-free DNA of metastatic cancer patients. Cancer Med. 2020 Mar;9(6):2052-2061. doi: 10.1002/cam4.2782. Epub 2020 Jan 28. PMID: 31991072; PMCID: PMC7064095.
Ma ML, Yakovenko S, Zhang H, Cheng SH, Apryshko V, Zhavoronkov A, Jiang P, Chan KCA, Chiu RWK, Lo YMD. Fetal mitochondrial DNA in maternal plasma in surrogate pregnancies: Detection and topology. Prenat Diagn. 2021 Feb;41(3):368-375. doi: 10.1002/pd.5860. Epub 2020 Nov 12. PMID: 33140416; PMCID: PMC7984455.
文献中提及的数据分析部分相对属于常规范畴。虽然自己以前做病原基因组分析没有接触过论文中涉及的少数适合人类基因组分析的软件，但是这些软件我之前也有所耳闻，并且对于其使用或分析还算有些了解。并没有涉及到可以特异性去除intracellular的步骤。于是我判断有可能在NGS数据处理前cfDNA已经被特异性富集了。因此，我特别关注了论文中提及的cfDNA提取及文库构建的方法描述。并关注到了几个试剂盒。
cfDNA提取及建库试剂盒
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit
这款试剂盒可以高效完成人类血浆、血清及尿液中cfDNA或cfRNA的浓缩及纯化，可以在QIAcube Connect全自动核酸纯化仪上实现自动化实验。整个试剂盒仅需裂解、结合、洗涤和洗脱完成cfDNA的提取及纯化。
EZ2 Connect Tip Rack, Large Volume
这款试剂盒同样是QIAamp的产品，它的优势在于处理大体积（8 mL）样品的cfDNA提取纯化。并且该款试剂盒同样可以适配于自动化核酸提取仪。
Oncomine™ Pan‐Cancer Cell‐Free Assay
赛默飞公司的Oncomine 泛癌无细胞检测是检测从全血血浆浆组分中分离出肿瘤来源 DNA 和 RNA 中多个靶标的完整解决方案的一部分。该测定试剂盒提供了试剂，以及用于从单管 10 mL 全血的血浆组分中获得的无细胞总核酸 (cfTNA) 制备扩增子文库的一池多重 PCR 引物，利用多重PCR扩增原理特异性富集无细胞游离核酸。该文库可用于高度多重靶向下一代测序 (NGS)。
TruSeq Nano HT Kit (Illumina)
cfDNA建库试剂盒用到了我博士期间病毒基因组测序的建库试剂盒，从原理上来说cfDNA和病毒的文库构建都属于微量核酸文库构建。所以在建库试剂盒使用上是互通的。由于我博士期间课题组通过前期的摸索发现了诺唯赞公司的微量核酸建库试剂盒可以替代Illumina的，所以我推测或许cfDNA的微量核酸建库策略也可以采用诺唯赞等国产试剂替代。从而起到降低成本的效果。但是具体是否可以完美替代需要用实际数据对比。
总结
从目前的文献调研来看，cfDNA核酸提取有一套特有的提取模式。但是建库策略采用的是微量核酸建库策略，这种建库策略和病毒基因组测序的建库策略类似。因此为了保证测序数据中具有高质量高丰度的cfDNA，NGS前处理部分已经通过专业的试剂盒做到了特异性富集纯化cfDNA。
写在后面的
目前看见的文献中使用的大部分无细胞游离核酸提取建库的试剂盒还是国外的试剂盒，很少有看见国内的。如果国内有相关产品，欢迎作为销售或技术的读者向我推荐相关产品。有助于我更好地理解相关实验。