案例分享|FFPE空间转录组揭示人肺组织感染 SARS-CoV-2的空间共定位

目前关于宿主如何对病原体作出反应，以及病原体感染如何参与各种生物学过程和影响疾病状态的基础研究仍然较少。尽管单细胞转录组学方法已经阐明由病原体引起的细胞异质性以及这些异质性如何与疾病相关联的问题，但这种方法限制了对病原体局部感染的研究。

为了提高对细胞宿主在空间分子相互作用方面的理解，并获得能够共同捕获宿主和病原体的空间转录组信息，2022年3月，bioRxiv收录的《Dual spatially resolved transcriptomics for SARS-CoV-2 host-pathogen colocalization studies in humans》一文中，作者利用FFPE空间转录组技术从感染新冠病毒的患者肺石蜡包埋组织切片中，捕获了宿主和病原体空间基因的表达情况，验证了对SARS-CoV-2的空间检测。

1 空间转录组可同时捕获人类和SARS-CoV-2的空间转录组信息

为了研究SARS-CoV-2对人肺部局部感染的影响，作者提出了空间基因表达法，同时捕捉人与SARS-CoV-2全转录组信息。共分析了5例肺组织样本，3个来自COVID-19患者（1C、2C、3C），2个来自对照患者（4nC、5nC）的13个组织切片中的16688个人类基因和10个SARS-CoV-2基因转录本。其中SARS-CoV-2探针专门用于获取SARS-CoV-2信息（图1b）。为了验证SARS-CoV-2探针的病毒检测效果，作者将ST病毒检测与RNAScope病毒检测方法进行了比较。发现ST的平均特异性为94.92%（图1C）。二次验证也证实了ST方法可以准确捕获SARS-CoV- 2信息。此外，SARS-CoV-2探针在检测SARS-CoV-2转录组的同时不影响人类转录组的捕获效率。

图1 空间转录组学对人类和SARS-CoV-2转录组的双重检测

2 SARS-CoV-2基因表达水平不同，但其空间分布相似

在COVID-19切片中，9.5% 的位点呈现SARS-CoV-2 转录信号。共捕获了多达9种不同的SARS-CoV-2基因信息。通过观察COVID-19样本中SARS-CoV-2+斑点的总体分布，发现不同患者的SARS-CoV-2+斑点百分比有所差异（C为33.6%，2C为1.1%，3C为1.0-1.6%）（图2g）。此外，在三个COVID-19样本中观察到不同SARS-CoV-2基因转录本的丰度有所不同（图2h）。尽管SARS-CoV-2转录本在基因之间的丰度不同，但每个基因在样品1C和3C之间的空间分布相当均匀，而对于2C，转录本显示出更局部的空间分布（图2i）。结合先前的研究推测SARS-CoV-2基因丰度的变异可能受到SARS-CoV-2探针与病毒基因组RNA（gRNA）和亚基因组RNA（sgRNA）结合的影响。

图2  SARS-CoV-2基因表达及分布统计

3 COVID-19诱导肺髓系细胞、成纤维细胞和肺泡上皮细胞的淋巴细胞浸润和表达转移

为了探索人类肺部细胞图谱以应对SARS-CoV-2感染，作者对空间转录组数据进行聚类，发现了六个不同的cluster（图3a）。差异分析显示，所有cluster都是不同细胞类型的混合物：骨髓细胞（cluster 1），内皮细胞（cluster 2），B细胞/浆细胞（cluster 3），上皮细胞（cluster 4）和成纤维细胞（cluster 6）（图3b-c）。SARS-CoV-2+斑点出现在不同的区域，但是在任何簇中都没有明显的富集（图3a），可能是由于空间转录组学尚未达到单细胞水平的分辨率导致的。

本研究纳入的三种COVID-19肺部样本均代表晚期肺炎，显示出一致的组织病理学特征，包括组织弥漫性肺泡损伤，广泛纤维化和白细胞浸润，并伴有低病毒载量。COVID-19肺切片的差异基因主要由浆细胞，活化成纤维细胞，炎症细胞因子和补体因子主导图（3d）。

为研究上皮细胞发生的生物学变化，作者对cluster 4进行了进一步的亚聚类。在以肺细胞为主的亚群1中，COVID-19肺组织中2型肺泡上皮（AT2）细胞标志物的表达明显升高（图 3e）。这些变化表明病变组织中AT2细胞发生了增生性扩增。

图3 人类宿主对SARS-CoV-2感染的反应

4 SARS-CoV-2和人类转录组的共定位分析可识别RNA代谢和NFκB途径激活的失调

由于可以单独捕获人类和SARS-CoV-2空间转录组，使得能够进行共定位研究，并鉴定由肺细胞中病毒mRNA引起的宿主基因表达变化。作者通过比较SARS-CoV-2+和SARS-CoV-2-斑点中仅COVID-19组织切片中人类基因的表达模式，发现了几种参与RNA代谢的基因受病毒mRNA的影响（图4f）。值得注意的是，作者发现RNase1基因在SARS-CoV-2+斑点中下调，可能阻断病毒RNA在主动感染细胞环境中的降解（图4f-g）。

前期的研究强调了NFκB途径作为COVID-19发病机制的中枢信号通路和细胞因子风暴的发起者。根据SARS-COV-2病毒直接诱导NFκB途径的研究，作者发现NFKB2和NFKBIA以及CXCL9，CCL17和CCL21在SARS-CoV-2+斑点中上调表达（图4f-g）。

图4 共定位分析

本文利用空间转录组技术从感染新冠病毒的人肺石蜡包埋（FFPE）组织切片中捕获宿主和病原体空间基因的表达情况。COVID-19 组织表现出宿主免疫反应的上调，例如炎性细胞因子、淋巴细胞和成纤维细胞标志物的表达增加。共定位分析表明，SARS-CoV-2+斑点呈现出宿主RNA代谢、自噬、NFκB和干扰素反应途径的变化。未来可以利用本文提出的方法，探索不同的SARS-CoV-2基因如何通过特异性SARS-CoV-2基因与人类转录组的共定位来调节宿主基因的表达，为宿主对病原体感染的反应提供新见解。