文章解读|多组学方法探讨黄芪龙胆颗粒对缺血性脑卒中的作用机制

经过长期的临床应用，中医在脑卒中治疗方面积累了丰富的经验。黄芪龙胆颗粒剂是临床上用于治疗急性缺血性脑卒中的中药方剂。然而，其抗缺血性脑卒中的机制尚不清楚。本研究旨在确定黄芪龙胆颗粒（HQLDG）对缺血性脑卒中的作用，并探讨其作用机制。

已有研究表明，肠道微生物群在缺血性卒中的发展中起着重要作用。肠道菌群可能通过介导代谢反应、神经递质和免疫功能等参与宿主神经系统功能。最新研究表明，肠道的炎症和免疫反应在缺血性脑卒中的病理生理中起着关键作用，可能是治疗缺血性脑卒中的重要靶点。

HQLDG方剂中含有以下草药：黄芪、龙胆、人参、桂皮、麻黄、川芎。目前已证实HQLDG在临床上是有效的，但其治疗缺血性脑卒中的潜在机制尚不清楚。本研究旨在探讨HQLDG抗缺血性脑卒中的作用机制。

经HQLDG处理后，细胞形态和排列得到改善。采用大脑中动脉闭塞法制备缺血性脑卒中小鼠模型。HQLDG显著降低梗死面积和神经学评分。此外，HQLDG可以改善小鼠脑组织染色病理，包括改善细胞形态。这些结果提示HQLDG可能对缺血性脑卒中具有保护作用。

图1 HQLDG对小鼠缺血性脑卒中损伤有保护作用

虑到HQLDG对肠道菌群的调节作用，下一步对肠道屏障的完整性进行评价。如图2A所示，tMCAO处理组结肠组织浆膜层疏松，单层柱状细胞损伤。此外，tMCAO处理组肠道结构中有明显的炎症细胞浸润。HQLDG可改善肠道病理，上调肠道屏障基因ZO-1、Occludin和Claudin-1的表达。此外，HQLDG处理可进一步保护tMCAO小鼠肠屏障和血脑屏障的损伤（图2B-D）。

图2 HQLDG保护肠道完整性免受缺血性脑卒中损伤

微生物多样性分析显示，经tMCAO处理的小鼠中拟杆菌、乳酸菌、Alloprevotella和g_Akkermansia发生了变化。其中，g_Akkermansia丰度在tMCAO小鼠中显著降低。HQLDG处理小鼠的g_Akkermansia丰度增加。先前的研究报道了该菌与色氨酸代谢的密切关系，以及其调节宿主免疫系统的潜力。

图3  HQLDG调节缺血性脑卒中小鼠肠道微生物多样性

图4 HQLDG对缺血性脑卒中小鼠肠道微生物结构的调节作用

图5 HQLDG干预后属水平关键微生物变化的鉴定

通过代谢组学研究HQLDG处理组和tMCAO处理组的代谢差异。差异代谢物KEGG通路分析显示，HQLDG调控的前15条通路分别是小细胞肺癌、色氨酸代谢、蛋白质消化吸收、铁死亡等（图6C）。3-吲哚丙酸属于色氨酸代谢，VIP评分较高（图6D）。接下来，本研究进行了针对色氨酸的代谢组学分析，以确定HQLDG对色氨酸代谢的调节作用。如图7所示，HQLDG能显著降低血清中吲哚、吲哚-3-丙酸、吲哚-3-甲醛和吲哚-3-乙酸的含量（图7A-D），提高血清中吲哚硫酸酯钾盐和吲哚-3-乳酸的含量（图7E-F）。这些代谢物属于色氨酸代谢的吲哚途径，与免疫调节密切相关。

图6 HQLDG调节缺血性脑卒中损伤小鼠非靶向代谢组研究

图7 HQLDG干预后关键代谢物变化的鉴定

热图聚类分析显示，HQLDG处理可以调节多种基因的表达（P<0.01，图8A）。火山图显示HQLDG调控的基因，其中上调基因47个，下调基因218个（P<0.05，图8B）。KEGG通路富集分析表明，HQLDG显著下调IL-17信号通路、Th17细胞分化和其他几种炎症通路（图8C）。GO富集分析表明，HQLDG可以有效调节多种免疫相关功能，如自身免疫反应、抗原递呈过程以及免疫球蛋白和抗原结合（图8D）。

图8 RNA测序分析揭示HQLDG对缺血性脑卒中小鼠的作用机制

采用FITC-葡聚糖和Evans Blue 检测脑血屏障（BBB）的完整性。tMCAO处理组中FITC -葡聚糖明显升高。HQLDG处理显著降低血液中FITC -葡聚糖含量（图9A）。tMCAO治疗组脑组织EB明显升高。HQLDG处理显著降低脑内EB含量（图9B）。ELISA试剂盒检测血清IL-17A和IL-22。tMCAO处理组大鼠血清中IL-17A、IL-22浓度显著升高。HQLDG显著降低血清中IL-17A和IL-22的浓度。此外，移植HQLDG处理小鼠的粪便微生物群可显著降低血清中IL-17A和IL-22的浓度。然而，抗生素与HQLDG联合治疗削弱了HQLDG对血清IL-17A和IL-22的抑制作用（图9C-D）。这些结果表明，肠道微生物群在HQLDG抗缺血性脑卒中的作用中起重要作用。

图9 HQLDG调节肠漏、脑漏及血清炎症因子

有研究报道，属于g_Akkermansia的Akkermansia muciniphila可以将Trp代谢为吲哚，Trp代谢可激活AhR，进而调控Th17信号。基于此，本研究使用抗生素和粪便微生物群移植来确定肠道微生物群在HQLDG抗缺血性脑卒中的作用。HQLDG治疗可显著降低血清炎症因子IL-17A、IL-22；下调Ahr、IL-17a、IL-22、rorc的表达。相反，去除肠道菌群后，HQLDG的作用受到损害。HQLDG处理小鼠移植的粪便微生物群对tMCAO损伤有积极作用。这些结果表明，肠道菌群调节可能是HQLDG抗tMCAO损伤的重要中介。AhR将色氨酸代谢和免疫调节联系起来。

接下来，使用AhR抑制剂来确定色氨酸代谢的作用。HQLDG可降低AhR和IL-17A的免疫荧光。肠道菌群去除后，与HQLDG处理组相比，AhR和IL-17A的免疫荧光增加。抑制AhR后，IL-17A的免疫荧光降低。

图10 HQLDG可调节小肠和脑组织中Ahr、IL-17a、IL-22和rorc的mRNA表达

图11 HQLDG下调脑组织AhR和IL-17A的表达

本研究表明HQLDG通过肠道微生物- Trp代谢- Th17/IL-17通路保护缺血性脑卒中，可能为HQLDG预防缺血性脑卒中提供新的思路。然而，它仍然有局限性。虽然本研究证实了肠道微生物群在HQLDG对小鼠缺血性卒中的保护作用中的重要作用，但仅使用16s rRNA测序对微生物群属进行了研究，还需要宏基因组学来进一步确认受影响微生物群物种的细节。此外，HQLDG不太可能通过单一途径起作用。HQLDG抗缺血性脑卒中的作用机制有待进一步的实验证实和揭示。