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研究背景
多囊肾病（PKD）是最常见的肾脏疾病，PKD患者发生终末期肾病的风险很高，特别是肾细胞癌（RCC）。肾细胞癌最常见的亚型是透明细胞肾细胞癌（ccRCC），占所有确诊病例的75-80%。透明细胞肾细胞癌是一种脂质代谢失调的恶性肿瘤。组蛋白甲基转移酶 SET 结构域 2 (SETD2) 是 ccRCC 中最常见突变的基因之一，在 ccRCC 发生和进展的功能通路的表观遗传调控中发挥着重要作用。然而，SETD2从PKD向ccRCC过渡的分子机制尚不清楚。
2023年11月21日，上海交通大学丁显廷及李力共同在《Nature Communications》发表题为“SETD2 deficiency accelerates sphingomyelin accumulation and promotes the development of renal cancer”的研究论文。本研究，作者在SETD2缺失诱导的PKD-ccRCC过渡小鼠模型中进行了代谢组学、脂质组学、转录组学和蛋白质组学分析。结果表明，SETD2缺失导致广泛的代谢重编程事件，最终导致鞘磷脂生物合成增强和肿瘤发生。临床ccRCC患者标本进一步证实了代谢重编程异常和鞘磷脂积累。本研究提供了高质量的多组学资源，揭示了SETD2对肿瘤发生过程中脂质代谢的调控机制。
发表期刊：Nature Communications
影响因子：16.6
测序技术：蛋白组、代谢组、转录组
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研究内容及结果
01. SETD2缺失诱导的脂质积累和PKD-ccRCC转化的多组学分析
为探讨SETD2在体内PKD-ccRCC转化中的潜在作用，作者通过在Ksp启动子（以下简称KM小鼠）的控制下过表达癌基因c-MYC生成PKD小鼠模型，并在该PKD小鼠（以下简称KMS小鼠）中使用相同的Ksp启动子敲除SETD2基因，建立ccRCC小鼠模型（图1b）。KM和KMS小鼠在20周龄时均观察到囊肿。KMS小鼠表现出明显的结构异常，其特征是油红O（一种用于脂质染色的溶色素重氮染料）和羧基酸酐酶9（一种诊断ccRCC的主要标记物）呈阳性染色（图1b-c）。同时，KMS小鼠的使用寿命比KM小鼠要短得多（图1d）。这些结果表明，SETD2的缺失增加了PKD小鼠的脂质积累和ccRCC的发生率，突出了SETD2在从PDK向ccRCC过渡过程中的代谢调节功能。
图1 SETD2缺失导致PKD小鼠的脂质积累和ccRCC生成
02. 代谢组学和脂质组学分析揭示 SETD2 缺失 ccRCC 中鞘磷脂的积累
为了鉴定PKD-ccRCC转化过程中SETD2缺失影响的代谢过程和代谢物，作者通过激光捕获显微解剖（LCM）分离富集KM小鼠肾囊肿和KMS小鼠肿瘤肿块。并对这些样品进行非靶向代谢组学和脂质组学分析。代谢组分析共鉴定到35个差异代谢物，与KM样本相比，鞘磷脂（SM）是KMS样本中最显著上调的代谢物（图2c），KEGG富集分析显示KMS样品中脂肪酸生物合成和氨基酸代谢发生改变（图2b）。脂质组学分析显示，共鉴定到九个脂质亚类，包括单酰基甘油（MG，0.46％）、二酰基甘油（DG，0.93％）、三酰基甘油（TG，80.55％）、鞘磷脂（SM，4.17％）、神经酰胺（Cer，4.17%）、葡萄糖神经酰胺（GlcCer，1.39%）、胆固醇酯（CE，5.56%）、甘油磷脂酰胆碱（PC，1.39%）和溶血甘油磷脂酰胆碱（LPC，1.39%）（图2d）。在这些脂质中，只有SM显著上调（图 2e）。为了深入了解显著增加的脂质，作者在KMS和KM样本之间鉴定了63种差异脂质。与非靶向代谢组学研究一致，与KM样本相比，SM（d40：1）和SM（d41：1）是KMS样本中脂质增加最为显著的样本（图2f）。结果表明，SETD2的缺失导致了PKD-ccRCC过渡过程中SM含量的增加。
图2 代谢组数据分析
03. 转录组学和蛋白质组学分析表明SETD2缺陷的ccRCC的代谢通路增强
为了进一步在mRNA和蛋白水平上表征PKD-ccRCC转化过程中SETD2缺失引发的生物学反应，作者收集KM小鼠的囊肿和KMS小鼠的肿瘤肿块进行转录组学和蛋白质组学研究。转录组共鉴定出1072个差异基因（图3b），与KM小鼠相比，KMS小鼠中有817个下调基因、255个上调基因（图3c）。蛋白质组学共鉴定出290个差异蛋白（图3b），与KM小鼠相比，KMS小鼠中有160个上调蛋白和130个下调蛋白（图3c）。富集分析显示，蛋白质组学的GO和KEGG变化（图 3e）比转录组数据的变化更显著（图 3d）。GSEA分析显示多个通路在蛋白质和mRNA水平上出现上调或下调，包括上调脂肪酸代谢过程和下调氨基酸代谢（图3f）。这些结果表明SETD2在 PKD-ccRCC 转变过程中调节广泛的代谢通路。
图3 转录组和蛋白组学分析
04. SETD2缺失通过调节代谢蛋白促进代谢重编程和鞘磷脂的生物合成
鉴于蛋白质组学分析清楚地表明代谢蛋白与SETD2缺失之间有很强的联系，作者进一步对蛋白质组学数据集进行了GSEA分析，以确定在PKD-ccRCC过渡过程中KEGG代谢通路的改变（图4a），SETD2缺陷肾组织中富集的上调通路与糖酵解、蛋白质分解代谢和脂质转运和代谢有关，表现为PKM、CLTC、SLC5A1和TECR等蛋白上调；SETD2缺失的肾组织中富集的下调通路如碳水化合物代谢、TCA循环和氨基酸代谢等，表现为IDH2、CS和GOT2等蛋白下调（图4b）。TCA循环（CS、CSL、ACO2、IDH1、IDH2、IDH3A、IDH3G、sucl2、SUCLG1、FH、MDH1、MDH2、ME1和PCK1）、氨基酸代谢（PSPH、SHMT2、GATM、GAMT、GPT2、GOT1、GOT2、BCAT1和BCAT2）组分下调，以及脂肪酸生物合成（HACD2、HACD3、TECR、THEM4和ACOT7）、碳水化合物吸收（SIS、OPP4、ACE2、SLC5A1、SLC2A2、SLC6A19、SLC16A10、ATP1A1和ATP1A2)、糖酵解（PGM2、PFKL、PFKM、PFKP、ENO3和PKM）的成分变化揭示了SETD2缺失会加速脂质生物合成的代谢重编程（图4c-d）。与KM样本相比，KMS样本中TECR、KDSR、LPCAT3蛋白水平增加，棕榈酸、鞘磷脂（d18:1/18:0）、鞘磷脂（d40:1）和鞘磷脂（d41:1）增加（图4e-f）。这些结果表明，SETD2缺陷诱导的代谢改变有助于SM的从头合成。
图4 SETD2 缺失导致代谢重编程和鞘磷脂生物合成上调
05. 在人ccRCC中，SETD2的缺失伴有鞘磷脂的增加
为了进一步研究SETD2和SM生物合成之间的临床功能相关性，作者分别分析了TCGA数据库和CPTAC数据库的ccRCC患者的转录组学和蛋白质组学数据。结果显示，在ccRCC样本中广泛观察到SETD2的突变和低表达。在蛋白水平上，小鼠和人的ccRCC中分别有17个和38个蛋白表达上调和下调，占总差异代谢蛋白的60.45%（图5a）。小鼠中由SETD2缺失导致的PFKP、SLC16A1、KDSR、LPCAT3、CDIPT等上调蛋白以及HAAO、GOT2、FABP3、IDH3G、GLYCTK等下调蛋白在人ccRCC中也分别持续升高或降低（图5b）。相关分析显示，SETD2与TCA循环和氨基酸代谢中的蛋白水平呈正相关。同时，SETD2临床水平低与糖酵解、蛋白质分解代谢和脂质生物合成中蛋白质的上调有关（图5c）。这些结果表明，在人类ccRCC中，SETD2缺失与代谢重编程呈正相关，这与之前在SETD2缺陷小鼠中的发现一致。为了进一步验证SETD2与SM生物合成之间的相关性，作者检测了人ccRCC样本中SETD2蛋白和SM的水平。免疫荧光（IF）染色显示，与邻近正常组织相比，ccRCC组织中SETD2蛋白水平降低。然后采用MALDI成像质谱（MALDI-IMS）测量配对的人ccRCC和SETD2水平改变的正常样本的原位代谢物丰度。数据显示，SETD2低肿瘤中的SMs显著增加，表明SETD2与SM之间存在明显的负相关关系（图5d）。综上所述，该研究结果表明，SETD2缺失与人类ccRCC中SM的上调显著相关。
图5 SETD2缺失与人ccRCC中鞘磷脂生物合成的上调有关
06. 抑制鞘磷脂生物合成可缓解小鼠SETD2缺失引起的症状
SETD2缺失可导致SM含量增加，这与癌症的起始、生长和免疫逃避密切相关。因此，作者提出假设：SM合成抑制剂可以在体内对SETD2缺失诱导的PKD-ccRCC转化具有保护作用。SM的从头合成是由丝氨酸棕榈酰辅酶a与棕榈酰辅酶a缩合而成，然后由丝氨酸棕榈酰转移酶（SPT）催化合成SM。Myriocin是鞘氨醇的类似物，作为一种有效的SPT抑制剂，在体内评估为一种代谢调节剂，对代谢综合征和癌症有良好的作用。在本研究中，作者对10周龄的KMS小鼠每2天腹腔注射Myriocin（0.3 mg/Kg），持续3个月，以阻断SM的从头合成，并每月进行超声检测（图6a）。与载体处理的KMS小鼠相比，Myriocin处理的KMS小鼠的SM水平显著下降。超声检测结果显示，Myriocin处理的小鼠的肿瘤肿块更少（图6b），且表现出更轻的体重和更小的肾脏大小（图6b-d）。组织学分析显示，与载体处理的小鼠相比，Myriocin处理的小鼠CA9染色减弱，脂质积累更少（图6ef）。这些结果直观地表明，使用Myriocin后，SETD2缺失引起的ccRCC相关症状得到缓解，PKD向ccRCC的进展被阻断。
图6 抑制鞘磷脂生物合成可缓解小鼠SETD2缺失引起的肿瘤发生症状
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研究结论
多组学分析可以全面了解癌症背后的分子机制，并有助于发现潜在的治疗靶点。在本研究中，作者对PKD小鼠（由c-MYC驱动）和ccRCC小鼠（由c-MYC和SETD2敲除驱动）进行了系统的多组学研究，以研究SETD2在PDK-ccRCC转化过程中在肿瘤代谢中的功能。作者首先收集了代谢组学和脂质组学数据，发现鞘磷脂（SM）是SETD2缺陷的ccRCC中脂质增加最多的一种。此外，作者还采用转录组学和蛋白质组学分析来交叉验证SETD2缺失后在mRNA和蛋白水平上的代谢改变。研究结果表明，SETD2的缺失促进了代谢重编程，并最终导致SM的从头生物合成和ccRCC形成的增强。SETD2在脂质代谢中的这一关键作用通过体内干预进一步证实，SETD2敲除引起的肿瘤症状可通过鞘磷脂生物合成的选择性抑制剂Myriocin缓解。因此，该研究结果揭示了SETD2在PDK向ccRCC过渡过程中在代谢重编程和脂质生物合成中的作用。
