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编者按：基因疗法听起来是一个充满了未来感的词汇，但事实上，基因疗法开始应用于人类疾病治疗可以追溯到上个世纪70年代。半个世纪以来，基因疗法从辉煌到暗淡，近年来再次复兴，科学家们从未停止对它的探索和提升，无论遇到何种阻碍也从未放弃。面对很多先天性遗传的疾病，这似乎是很多患者唯一的希望。
图片来源：123RF
1972年，《科学》杂志上发表了一篇文章，题为“Gene Therapy for Human Genetic Disease？”彼时，这是科学界的灵魂拷问，让人们看到了一个无限潜力的未来。此后的几十年间，关于基因治疗的研究数量激增。这篇论文首次揭示了基因治疗的巨大潜力方向——用来治疗人类的遗传性疾病。
两位科学家作者Theodore Friedmann教授和Richard Roblin教授在这篇文章中正式提出了一个概念，那就是通过基因工程方法，用“正确”的基因替换生物体细胞内原有的“错误”基因。
后来，这种治疗思路被称为基因替代疗法（Gene replacement therapy），成为了基因治疗中最经典的概念。对于遗传性疾病的治疗而言，这是一种非常直接的思路，特别适合双等位基因缺陷的疾病。
▲基因替代疗法的机理示意图。病毒载体携带健康的DNA序列，以替换特定的疾病DNA基因。一旦经过修饰的病毒载体进入细胞并释放出正确的DNA序列（1），它就会将目标DNA导向核DNA（2和3），随后被纳入到宿主基因组（4和5）中，从而产生预期的功能产物（6）。（图片来源：参考资料[2]）
这个概念听起来并不复杂，但是，历史告诉我们，知易行难，真正的成功往往不会那么一帆风顺。
经过科学家们多年的努力探索，1990年，一个4岁的小女孩儿Ashanti DeSilva接受了基因替代疗法的治疗。她患有一种名为adenosine deaminase deficiency（ADA）-SCID的疾病，这是一种由于腺苷脱氨酶（ADA）缺陷所导致的严重综合性免疫缺陷疾病。
科学家们使用病毒载体作为递送方法，通过体外基因工程，将健康的ADA基因导入到她自身细胞中，并将编辑后的细胞重新注射回她的体内。治疗后Ashanti DeSilva的健康状况得到了很大程度上的改善，拥有了接近于普通人的人生。
这是基因疗法的首次胜利，昭示着此前对于很多遗传性疾病完全束手无策的历史即将终结，成为基因疗法发展史上浓墨的一笔。
科学家们通过人体试验完成了对基因疗法的概念验证，证明了基因治疗的安全性和可行性，鼓舞了更多的临床试验开展起来。但短暂的辉煌并没有持续太久，1999年，首位在基因疗法中死亡的患者出现。在接受基因治疗后，这位患者出现了致命的免疫应答。
这是一个重要的转折点，从狂热到冷静，科学界开始重新审视所取得的胜利。原来我们距离真正驾驭基因疗法，还依然有很长的路要走。
导致患者死亡的致命免疫应答来自于什么原因呢？一切还要回到基因疗法本身。
在惯有的认知中，病毒是导致机体疾病的“杀手”，但在基因疗法的世界里，它们成为了疾病治疗的“助手”。病毒载体是基因疗法从概念走到现实的关键突破之一。
想要替换细胞内的“错误”基因，需要一个肩负这项使命的载体。理想的基因治疗载体应该可靠、高效地携带和传递治疗基因到靶细胞，并直接进行长期治疗表达。病毒恰好满足这些标准，它们能够将自身的遗传物质引入到宿主细胞内，并利用宿主的“细胞工厂”持续表达，是非常天然的载体。科学家们用治疗性基因组取代原有病毒基因组，去除病毒的复制和致病特性，将致病的病毒改造成为了适合作为基因转移的病毒载体。
大自然的进化赋予了病毒对细胞转染的功能，但相对应的，对抗外来病毒入侵的免疫系统也在持续的进化，可以及时识别包括病毒在内的外部感染因子，并启动免疫应答。
▲免疫系统对病毒载体的感知和信号通路示意图（图片来源：参考资料[3]）
虽然科学家们对病毒进行过改造，去除致病特性，但是，对免疫系统而言，病毒载体依然是蛋白衣壳内包裹着核酸分子。很多野生型病毒中能够触发免疫应答的结构在病毒载体中也依然存在。病毒的衣壳或包膜蛋白，对于宿主细胞而言都是外源蛋白，可成为适应性免疫应答的靶点。此外，病毒载体所携带的治疗性基因，同样也存在被体液和细胞免疫应答靶向的可能。
很多科学家认为，1999年首例基因疗法致死事件的重要原因之一，就是所使用的病毒载体。当时，科学家所使用的病毒载体是改造后的腺病毒，事实证明，这是一种具有强烈免疫原性的病毒，引发了免疫系统的疯狂反扑。
此后，科学家们重新在探索中前行，越来越多的病毒载体开始进入基因疗法的视野中，除了腺病毒（Ad），还有腺相关病毒（AAV）、慢病毒（LV）、鼠γ-逆转录病毒和单纯疱疹病毒（HSV）等。
▲不同病毒载体中，能够被免疫系统特异性识别的分子结构和抗原举例：（A）腺病毒载体；（B）腺相关病毒载体（AAV）；（C）慢病毒载体。（图片来源：参考资料[3]）
通常，免疫应答是机体最重要的自我防护，但是对于病毒作为载体的基因治疗而言，免疫介导的排斥反应是人类进行基因治疗最重要的挑战之一。一方面，全身给药时，用于治疗的病毒载体剂量会远超出常规的感染，容易引发免疫系统的强烈排斥；另一方面，如果此前在病毒中有过暴露，就会产生相应的抗体“记忆”，那么，免疫系统会第一时间对由其改造的载体进行清除，难以达到预期的治疗目的。
基因疗法本质上是一种个体化治疗，不同的患者体内会具有不同的免疫系统环境。因而，充分解读与病毒载体和替代基因相关的免疫应答机理，同时采取有针对性的载体使用策略，对于降低免疫介导的排斥反应，开发成功的基因疗法而言至关重要。
▲不同的病毒载体属性及其相关的免疫应答概述（图片来源：参考资料[3]）
那么，类似的免疫应答是不是对人体所有的器官“一视同仁”呢？并不尽然。
由于血液屏障的存在，人体内有一些特殊的器官是具有免疫特权（Immune Privilege）的。抗原在免疫特权位置会被物理屏障所隐藏，从而被免疫系统忽略。通常科学角度认为，免疫特权反映了一种进化适应，以保护重要结构免受针对病原体的炎症反应的损害。眼睛就是人体具有免疫特权的器官之一。
▲血-眼屏障使得眼睛成为了人体少数拥有免疫特权的器官之一（图片来源：参考资料[5]）
眼睛是理想的基因治疗候选对象，一方面，得益于眼睛是免疫特权空间，几重血-眼屏障使得眼睛与免疫系统相对独立。临床试验表明，使用腺相关病毒和慢病毒载体的治疗方案，没有引发实质上的免疫应答或全身性不良事件。另一方面，很多遗传性眼部疾病的突变已经被精准识别，为基因疗法开发提供了众多的靶点选择。
在基因疗法出现以前，人类对于很多遗传性失明的治疗束手无策。遗传性视网膜营养不良（Inherited retinal dystrophies，IRDs）就是一组罕见的由遗传缺陷所导致的视网膜变性的疾病。患者会在生命的早期和中期发生进行性、严重、和不可逆的双侧视力丧失。常见的IRDs相关的基因缺陷有200多种。
2017年，第一个用于遗传性视网膜营养不良治疗的基因疗法获FDA批准。这款名为Luxturna的疗法，靶向RPE65双等位基因突变引起的IRDs。Luxturna率先跨越了研究与开发的障碍，随后更多基因疗法进入临床，有望进一步打开眼科遗传性疾病治疗的新时代。
▲截至2019年12月，多个用于治疗遗传性视网膜营养不良的基因疗法进入临床（图片来源：参考资料[2]）
与生物制剂或小分子药物不同，基因治疗的效应在治疗进行后很难停止。随着越来越多基因疗法进入临床研究阶段，人们更加关注如何更好地避免和降低临床研究的风险。众所周知，临床前评价对于候选药物和疗法的安全性和有效性评价都非常重要，是临床试验准入的关键证据之一。其中，眼科新药的临床前评价尤其是瓶颈，能够提供相关评价的研发服务公司凤毛麟角。
药明康德测试事业部拥有专业的眼科平台，致力于打造临床前眼科药物评价一体化分析服务平台，为客户提供包括眼科药效、药代动力学、毒理等多种检测内容的一站式服务，数年来见证了许多在研新药从临床前研究步入临床试验阶段。
▲药明康德测试事业部眼科平台拥有30余种独家开发的药效学实验动物模型
眼睛是非常精密的器官，眼部药物的临床前评价与其他的药物和疗法一向不同。由于血-眼屏障的存在，会导致不少大分子递送效率低下，因而很多时候眼部的药物递送方式是局部的“直接”给药，这一点与很多其他疾病治疗时通过血液全身给药不同。再者，不同动物眼部解剖结构和功能差别很大，眼科实验和给药过程都异常精细。眼部基因疗法的临床前评价同样如此。
▲通过基因疗法治疗遗传性视网膜营养不良的流程示意图。在眼部，基因治疗主要采用玻璃体腔注射、视网膜下注射和脉络膜上注射，靶细胞类型是指导正确给药途径的必要因素。一般来说，玻璃体腔注射可靶向视网膜内层细胞，而视网膜下注射可将基因传递至视网膜外层细胞和视网膜色素上皮细胞。（图片来源：参考资料[2]）
眼部基因疗法临床前评价中经常采用的视网膜下腔注射给药，需要完备的眼科手术设备和器械，以及熟练的显微注射技术。在严格无菌操作下，借助手术显微镜视觉引导，将药物穿过玻璃体抵达视网膜的既定位置。注射后的眼部护理、体位摆放，甚至麻醉持续的时间都会影响疗法的测试结果，需要遵从极为专业的操作流程。这样的眼内注射与其说是“给药”，更像是一台精密的眼部显微“手术”。
眼部给药的过程可能会引发额外的并发症，包括黄斑裂孔、视网膜裂孔、白内障，以及永久性视力丧失，只有成功的临床前评价才能准确评估安全和风险，从而帮助有希望的疗法开启临床试验的大门。因此，眼部基因治疗的临床前评价从本质上准入门槛非常的高，依赖于复杂的技能，以及执行眼部显微外科手术所需的特殊培训。此外，给药后对副反应的识别与判断，种种复杂情况的观察与评价，以及测试报告的书写，都需要专业知识与经验的支持。
凡此种种，挑战重重，因此长期以来，对于临床前药效评价和毒理分析而言，眼科学药物测试和评价服务一直是产业界的稀缺资源。
由于所有的药物都需要进行眼部毒性的测试，经过多年的行业积累，药明康德眼科测试平台多方面的能力都在持续的项目实践中得到了很好的发展，能够为基因疗法的开发提供高品质的临床前测试服务，目前，多个项目正在平台上运转。
▲药明康德测试事业部眼科基因疗法临床前评价一体化分析服务平台能力
光明的未来在地平线已然升起，基因疗法迅速成为了眼部遗传性疾病最有希望的治疗选择之一，但也依然任重道远。虽然，眼部基因疗法的开发有独特的优势，并取得了长足的进步，但在生产、临床研究设计、长期安全性研究和未来基因疗法的商业化方面仍存在重大挑战。此外，转染效率和基因表达的持久性也同样是当前需要提升的方向。
仅遗传性视网膜营养不良就有超过220个基因牵涉到其发病机制。事实上，目前针对眼部遗传性疾病仅有少数靶点有成功的基因疗法上市，这里依然是一片蓝海，更广阔的空间等待着开启和探索。
眼睛是免疫的“禁区”，也是人类观察这个世界的窗口。药明康德测试事业部临床前眼科药物评价一体化分析服务平台，期待以专业的知识和能力，赋能全球合作伙伴眼部遗传疾病的基因疗法开发。我们期待，不远的未来，有更多优秀的基因疗法能够进入临床，为更多患者带去光明与希望！
参考资料：
[1] Theodore Friedmann and Richard Roblin, (1972), Gene Therapy for Human Genetic Disease?, Science, DOI: 10.1126/science.175.4025.949
[2] Dominic A. Prado, Marcy Acosta-Acero et al.,(2020), Gene therapy beyond luxturna: a new horizon of the treatment for inherited retinal disease, Curr Opin Ophthalmol 2020, 31:147–154, DOI:10.1097/ICU.0000000000000660
[3] Jamie L. Shirley,Ype P. de Jong et al.,(2020), Immune Responses to Viral Gene Therapy Vectors, Molecular Therapy Vol. 28 No 3,DOI: 10.1016/j.ymthe.2020.01.001
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[5] Marcelo L. Occhiutto , Fatima R. Freitas et al.,(2012), Breakdown of the Blood-Ocular Barrier as a Strategy for the Systemic Use of Nanosystems, Pharmaceutics. 2012 Jun; 4(2): 252–275, DOI: 10.3390/pharmaceutics4020252
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