

高通量DEL筛选验证策略：解决复杂产物的识别难题

药明康德

2021-05-18

导读：解决DEL筛选验证环节的一大“痛点”

近日，Bioconjugate Chemistry以封面文章刊登了药明康德HitS事业部在DEL筛选验证领域的新策略：通过DNA共价结合物重合成及对应亲和质谱技术解决DEL筛选验证环节的一大“痛点”—— 缺乏经济有效的手段系统性地验证DEL筛选结果，从而识别理论终产物与过程中副产物对筛选结果的影响。

PART1 背景介绍

PART2 难点解析

PART3 文章梳理

PART4 应用场景

PART1 背景介绍

DNA编码化合物库（DNA-Encoded Library, DEL）以其巨大的化学空间及高效便捷的筛选方法，已经成为新药苗头化合物发现的重要手段之一。DEL分子一端是小分子化合物，另一端是独特的DNA标签，中间是一段连接子。

DEL库的构建通过组合化学 “Split & Pool”的方法，一轮化学反应后，小分子端连上一个“分子积木”，与之对应的DNA序列也会通过酶连反应添加到DEL分子的标签端，确保识别的唯一性。通过多步反应，可在短时间内构建十亿甚至百亿级别的分子【图1】。

【图1】应用组合化学“Split & Pool”方法合成DEL

由于原理限制，DEL库构建的反应过程中无法对DEL分子进行纯化。因此多轮反应后，很有可能出现一段DNA序列标记的是整个反应过程的情况，即反应过程中的终产物、中间产物和副产物都会被同一段DNA序列标记【图2】。

【图2】 DEL多种产物的可能组合示意图

PART2 难点解析

DEL技术在不断突破创新的同时，也面临多重技术挑战，比如在筛选后化合物活性验证环节，有一个问题始终困扰着DEL领域科研工作者——如何有效辨别DEL筛选结果中每一种DNA标签实际对应的小分子化合物结构？

基于终产物的有机合成及对应活性检测，是一种常规的验证方法。但该方法无法分辨由中间产物或反应副产物引起的结合，是DEL筛选假阳性信号产生的一个重要原因。

PART3 文章梳理

药明康德HitS团队在这篇题为 “Triaging of DNA-Encoded Library Selection Results by High-Throughput Resynthesis of DNA-conjugates and Affinity Selection Mass Spectrometry”的文章中，结合详实的实验与统计数据，展示了On-DNA亲和质谱（Affinity Selection Mass Spectrometry, ASMS）在DNA 编码化合物库（DNA-encoded Library, DEL）潜在苗头化合物鉴定与验证环节中的前瞻性应用及创新性结论，为DEL筛选验证提供了一种经济高效的方法。

该方法利用高通量平行合成得到带有DNA标签的同一路线反应混合物，并通过重复DEL亲和筛选实验，得到与靶蛋白结合的DEL分子，之后借助质谱检测得到精确的分子量并分析出对应分子的结构信息。后续可基于On-DNA ASMS的数据，单独合成不带DNA标签的化合物，再进行常规的结合和功能验证【图3】。

【图3】 On-DNA ASMS策略简介

作者首先从BRD4-BD1的DEL筛选数据中挑选出两个系列的分子，对带有DNA标签的分子进行重合成与ASMS验证。重合成步骤遵循了DEL库合成时采用的原料选择与路线设置，反应副产物和中间产物均存在于同一反应路线后的样品中。再将该反应路线产物与靶点共孵育，参考DEL筛选相关步骤，直接对一轮筛选之后的洗脱产物进行质谱检测。

通过分析产物的分子量，作者发现该路线上的理论终产物及反应中间体均能与BRD4-BD1结合【图4】。

【图4】 On-DNA ASMS验证结果

因此，研究人员重新合成不带DNA标签的理论终产物和中间产物结构，并使用表面等离子共振 (Surface Plasmon Resonance, SPR)和传统ASMS进行验证，结果表明不带DNA标签的化合物分子也可以与BRD4-BD1结合【图5】。

【图5】 SPR验证结果

为了进一步提高DEL分子的合成效率，作者开发出一套基于96孔板的高通量平行合成方法，可针对不同路线的库分子，应用不同的反应方法，大量且快速地进行平行反应【图6】。据统计数据显示，相比传统单管合成方法，该方法可以提供4倍以上的合成效率，并且产物质量基本保持不变，显著提升反应通量的同时，大幅节省人力成本。

【图6】高通量平行合成示意图

接下来，基于TDO2靶点的筛选结果，作者通过高通量平行的方式合成了95个带有DNA标签的分子并进行了ASMS验证。结果显示，43个分子可以与靶点TDO2结合（阳性率为45.3%），其中副产物或中间体分子占比较高（超过34.9%的阳性分子为反应副产物或中间产物）。结合该数据，作者进一步分析了阳性分子种类与其对应的化学反应产率的关系【图7】。

【图7】 (A)副产物及中间产物检出率；(B)反应产率；

(C)阳性率及(D)富集相关性分析

结论如下：

1）理论终产物产率较低的样品中，副产物及中间产物的ASMS阳性结果占比较高；

2）终产物的产率与阳性率无关；

3）阳性分子的产率与DEL筛选后的富集度（Enrichment）也无明显关联。

由结论2和3可以推断DEL筛选的多轮步骤本身会减弱反应产率对于DEL分子富集度的影响。

尤其值得关注的是，基于ASMS结果所计算的回收率（Recovery Rate），即洗脱样品分子富集丰度与孵育前参照样品分子丰度的比值，可以与DEL筛选后的富集度数值进行相关性计算，并根据相关性大小辅助判断富集度计算方法的可信程度。通常情况下，相关性系数R^2越接近1，说明拟合度越好，该计算方法可信度越高。根据现有数据，作者对领域内常用的多种DEL数据解读方法进行了对比，发现校正后的Enrichment和Recovery Rate在一定程度上呈正相关【图8】。这一发现表明使用正确的数据解读方法，可以提高DEL筛选数据对分子的相对亲和力的判断能力。

目前，行业内缺乏分析DEL筛选数据的统一标准，本文介绍的DEL筛选后on-DNA分子高通量合成及亲和质谱鉴定方法，为评价DEL技术提供了一个可行的方案，对于DEL来源的苗头化合物的评估与验证具有重要的作用。作为一个高效便捷的验证工具，它填补了DEL领域一直以来从on-DNA分子直接向off-DNA分子转化的空白，真正发挥了验证环节的作用，有利于提高筛选的成功率，有助于指导筛选方法的进一步迭代和应用。

【图8】 Enrichment与ASMS Recovery Rate的相关性分析

PART4 应用场景

减少筛选假阳性

DEL筛选后，我们可以获得数以万计乃至百万计被富集的活性分子。传统验证方法是：根据经验挑选数个最有代表性的DEL理论终产物分子来进行有机合成验证，由于未将库建设中的副产物、中间产物考虑进去，这种方法有可能挑中假阳性分子，导致验证结果的阳性率偏低。再基于此方法挑选的分子进行有机合成验证，将耗费大量的人力、财力。此时，通过高通量合成on-DNA分子及亲和质谱鉴定，我们可以经济高效地对候选分子进行验证，还能兼顾因中间产物/副产物与靶点结合而非理论终产物与靶点结合的结果信息。

进一步获取潜在SAR信息

通过on-DNA分子高通量合成及亲和质谱鉴定方法，我们可以获得DEL分子中间产物、终产物和副产物一系列类似物与靶点的结合关系，为后续的结构优化提供更多的有效信息。

【参考文献】

Su, W., Ge, R., Ding, D., Chen, W., Wang, W., Yan, H., Wang, W., Yuan, Y., Liu, H., Zhang, M., Zhang, J., Shu, Q., Satz, A. L., & Kuai, L. (2021). Triaging of DNA-Encoded Library Selection Results by High-Throughput Resynthesis of DNA-Conjugate and Affinity Selection Mass Spectrometry. Bioconjugate chemistry, 10.1021/acs.bioconjchem.1c00170. Advance online publication. https://doi.org/10.1021/acs.bioconjchem.1c00170

关于药明康德研究服务部HitS事业部

药明康德HitS事业部为全球药物研发行业提供具有竞争力的一体化靶标到苗头化合物发现解决方案。本着以研究为首任，以客户为中心的宗旨，药明康德HitS事业部通过高质量和个性化的研发服务，助力客户提升先导化合物开发效率，服务范围涵盖蛋白科学、DNA编码化合物库技术、生物物理学和结构生物学研究等领域。

如果您对DEL平台感兴趣，您可以通过以下方式联系我们：

DEL_service@wuxiapptec.com

https://hits.wuxiapptec.com

（扫码访问HitS事业部官网）