前沿 | 张锋团队重磅《科学》！发现188个新型CRISPR系统，基因编辑有望迎来新突破

药明康德

2023-11-29

导读：学术经纬

▎药明康德内容团队编辑

30年前的西班牙阿利坎特大学，一位读博中的年轻人Francisco Mojica正在研究来自当地海滩的耐盐性古菌。在一种古菌的DNA序列中，Mojica注意到一个难以解释的奇怪现象：一段长30个碱基的片段会以相同的间隔规律性地重复。在那之后，经过十年的研究，Mojica终于揭开了这种重复序列的功能：作为古菌与细菌的“免疫系统”，这些序列能记住噬菌体的遗传特征，从而抵抗后者的感染。这些序列有一个我们无比熟悉的名字：CRISPR。

Mojica的这一发现并没有立即得到认可，他的成果被多家学术期刊拒稿，最终发表在一本影响力不高的期刊Journal of Molecular Evolution上。但很快，科学界意识到了CRISPR的重要潜力，后面就是我们熟知的故事了。2012年，Emmanuelle Charpentier教授和Jennifer Doudna教授发表了CRISPR-Cas9基因编辑系统，利用Cas9核酸内切酶实现了特定位点对DNA的精准切割；不到一年后，张锋教授团队首次将CRISPR-Cas9基因编辑系统改进并应用于哺乳动物和人类细胞。今天，CRISPR已经成为改写生物学研究与疾病治疗的革命性工具。

不过，科学家们并不满足于此，他们仍在挖掘CRISPR系统的更多潜力。在最新一期《科学》杂志上，MIT、Broad研究所的张锋教授团队就与美国国立卫生研究院的Eugene Koonin教授合作，借助其开发的全新算法，从数十亿个蛋白质序列中发现了188个此前未知的新型CRISPR相关系统，并且可能将CRISPR系统的类型拓展至7大类。这一发现进一步证实CRISPR系统的多样性，并且有望带来新型基因编辑工具。

近些年来，通过对蛋白质序列数据库的计算检索，CRISPR工具箱在近年间已经得到了大幅扩展。到目前为止，科学家们已经鉴定出了6类CRISPR系统，依次命名为I-VI。其中，基因编辑中最常用的CRISPR-Cas9系统就属于II型。

我们知道，CRISPR系统包含两个重要组成部分：识别并结合噬菌体DNA或RNA的向导RNA，以及在向导RNA指示的位点切割或干扰遗传物质的酶。这些不同类型的CRISPR系统使用不同的酶，其识别、结合与切割遗传物质的方式也各不相同。

但这还不是CRISPR系统的全部，一些未知的新系统很可能藏在自然界某些罕见的细菌或古菌中。新型CRISPR系统的发现有望推动生物技术的进一步发展，并且帮助开发更加安全有效的基因疗法。然而，要挖掘包含数十亿蛋白质、以指数增长的数据集，传统的算法显得力不从心。

为了在自然界找到更加多样的CRISPR系统，在最新研究中，研究团队开发了一款名为FLSHclust（意为flash clust）的全新算法。

▲FLSHclust算法示意图（图片来源：参考资料[1]）

FLSHclust是一种基于序列相似性，利用大数据对蛋白质进行聚类的算法。FLSHclust可以对公开数据库中的基因序列进行分析，这些数据包含了收集自南极湖泊、狗的唾液、啤酒厂等广泛来源的细菌与古菌。最终的数据库包括80亿个蛋白和1020万个CRISPR阵列。通过寻找相似但不完全相同的序列，研究将其分为约5亿个簇，从宏基因组数据库中寻找CRISPR相关基因。

相比于已有的工具方法，FLSHclust可以快速高效地分析海量的蛋白质序列数据库，在数周内探索数十亿的蛋白质和DNA序列，而同样的工作在此前需要几个月时间才能完成。

利用FLSHclust，研究团队从数十亿个蛋白质序列中发现了大约13万个与CRISPR相关的基因，其中188个属于此前未知的新型CRISPR相关系统。

▲CRISPR-Cas9系统（图片来源：药明康德内容团队）

在188个新型CRISPR相关系统中，研究团队对其中4种进行了进一步的详细介绍。他们发现，这些CRISPR系统可以通过各种策略来攻击噬菌体，包括解开DNA双螺旋，以及通过允许基因插入或删除的方式切割DNA。

具体而言，在4个得到详细研究的CRISPR系统中，首先是两个I型CRISPR系统的新变体。这两个I型系统包含了插入Cas蛋白不同亚基（Cas8和Cas5）的HNH核酸酶结构域，因此分别被命名为Cas8-HNH和Cas5-HNH。研究显示，这两个系统均能进行精准的DNA双链与单链剪切。它们使用的是32个碱基对的向导RNA，相比于常用的Cas9系统的20个核苷酸向导要更长，因此有潜力用于开发更精准、不易脱靶的基因编辑系统。研究还证实这两个系统都可以应用于人类细胞的基因组编辑，其中Cas8-HNH还具有高度特异性。这些I型CRISPR系统的另一个优势是，由于大小与CRISPR-Cas9相似，因此或许可以利用已有的递送技术，将其递送至动物或人类细胞中。

▲研究发现了多个此前未知的CRISPR-Cas系统（图片来源：参考资料[1]）

另一个新发现的CRISPR系统是IV型的DinG-HNH。在这个系统中，HNH核酸酶结构域插入了CRISPR相关的DNA损伤诱导基因G（DinG）样解旋酶。研究团队发现，该系统表现出RNA引导的PAM依赖性双链DNA降解，这需要DinG-HNH蛋白的三磷酸腺苷水解以及HNH核酸酶功能。

以上3个全新CRISPR系统的发现表明，通过对Cas蛋白组成与子域的模块化替换，CRISPR系统能够实现演化。除此之外，研究还发现了一个不同于已知CRISPR类型的候选VII型系统，包括一个小型的Cas7-Cas5效应系统，以及一个包含b-CASP结构域的独特干扰蛋白。该系统可以精确靶向RNA，从而用于RNA编辑。

作者表示，寻找全新类型的CRISPR系统愈加困难，VII型以及其他尚未被确定的类型，在自然界都是极其罕见的。从新发现的CRISPR系统中，我们看到了用于哺乳动物细胞编辑，以及用于诊断、记录细胞内活性的潜力。这项研究展示了CRISPR前所未有的多样性与灵活性，随着数据库的增长，还可能有更多罕见的系统有待发现。

封面图来源：张锋教授实验室主页

参考资料：

[1] Altae-Tran, H. et al. Uncovering the functional diversity of rare CRISPR-Cas systems with deep terascale clustering. Science (2023). DOI: 10.1126/science.adi1910

[2] Search algorithm reveals nearly 200 new kinds of CRISPR systems. Retrieved Nov. 24, 2023 from https://mcgovern.mit.edu/2023/11/23/search-algorithm-reveals-nearly-200-new-kinds-of-crispr-systems/

[3] ‘Treasure trove’ of new CRISPR systems holds promise for genome editing. Retrieved Nov. 24, 2023 from https://www.nature.com/articles/d41586-023-03697-w

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