消除脱靶效应！从预料之外的实验结果，研发新一代碱基编辑工具 | 专访上科大陈佳教授

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消除脱靶效应！从预料之外的实验结果，研发新一代碱基编辑工具 | 专访上科大陈佳教授

药明康德

2023-11-22

导读：学术经纬

▎药明康德内容团队编辑

药明康德内容团队推出细胞和基因疗法系列科学讲座，邀请细胞和基因疗法领域具有影响力的学者，通过视频讲座从各自角度深度解读前沿科学进展、呈现对领域发展的深刻洞见，共同推动创新疗法的研究进展、加速为全球患者带来突破。

在本期视频讲座中，我们邀请到上海科技大学生命科学与技术学院教授、基因编辑中心主任陈佳教授，为我们分享“新型碱基编辑技术的开发与应用”。

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2014年，结束了在美国国立卫生研究院（NIH）的5年博士后研究后，陈佳教授在上海科技大学组建了自己的实验室，从事DNA损伤修复机制的基础研究。此时，生命科学领域一场方兴未艾的技术革命吸引了陈佳教授的关注。

2012年，Emmanuelle Charpentier教授和Jennifer Doudna教授发表了CRISPR/Cas9基因编辑系统，利用Cas9核酸内切酶实现了特定位点对DNA的精准切割；不到一年后，张锋教授团队首次将CRISPR-Cas9基因编辑系统改进并应用于哺乳动物和人类细胞。自此，人们拥有了能高效改写DNA的“基因魔剪”。

尽管DNA损伤修复的基础研究与基因编辑技术看似相距甚远，但在陈佳教授看来，两者其实暗藏着密切的联系：“DNA的损伤修复不受我们控制，产生随机的修复产物；相反如果我们能控制DNA损伤修复的过程，这个可控的改变就是基因编辑。”

因此，长期从事基础研究的陈佳教授依旧对势头火热的基因编辑技术保持了开放的心态。而最终促使陈佳教授转变研究方向的，是碱基编辑技术的出现。

从基础到技术：打造改写碱基的“笔”

毫无疑问，CRISPR/Cas9基因编辑具有跨时代的意义，但这项技术在临床治疗中也存在着难以克服的安全隐患。由于核酸酶在编辑时需要首先切断DNA双链，这个过程中的任何错误——无论是染色体的缺失、易位，还是识别错碱基序列导致的脱靶效应——以及DNA双链断裂本身导致的细胞凋亡或癌变，都可能让基因编辑成为孕育着危险的温床。

2016年，哈佛大学刘如谦（David Liu）教授提出了全新的碱基编辑理念（Komor et al.，Nature，2016）。对于CRISPR/Cas9与碱基编辑的对比，陈佳教授用了这样的比喻：CRISPR/Cas9需要在基因组中产生大片段的创伤再予以修复，如同是一场伤筋动骨的手术；而碱基编辑则是“化刀为笔”，不再用“手术刀”来剪切DNA，而是直接用“笔”改写错误的字母，也就是碱基。因此，碱基编辑有机会从根本上避免DNA双链断裂带来的风险，对基因突变进行更为精准的定点校正。

根据改写的碱基不同，碱基编辑器包含胞嘧啶碱基编辑器（CBE）和腺嘌呤碱基编辑器（ABE）两类。其中，胞嘧啶碱基编辑使用的“笔”是胞嘧啶脱氨酶，这种酶能够将靶点处的胞嘧啶转变为尿嘧啶。而陈佳教授研究的，恰好是这支“笔”的工作机制。

▲胞嘧啶碱基编辑器和腺嘌呤碱基编辑器的工作原理（图片来源：Wang et al.，Molecular Cancer，2022）

“由于碱基编辑与我之前做的胞嘧啶脱氨酶损伤修复机制关联性非常强，当时我想可以尝试进行工具的研发。尝试之后我发现生物技术方向相当适合，于是我就逐渐地将实验室的重心从纯基础研究转变成基于机制研究的生物技术研发。”在陈佳教授看来，内心的喜好加上合适的时机，最终决定了自己的科研方向。

攻克脱靶效应：源自意外的发现

在此后数年间，陈佳教授团队与合作者先后开发出了具有高编辑效率与高产物纯度的增强型碱基编辑器（enhanced Base Editor，eBE）、能在基因组A/T富集区域内精准编辑的Cpf1（一种与Cas9互补的新型蛋白）的碱基编辑器、在G/C富集区域和高甲基化DNA区域内实现高效编辑的hA3A碱基编辑器，以及将Cpf1与hA3A结合，能避免激活细胞DNA损伤响应通路，从而避免细胞凋亡的碱基编辑系统BEACON。

这些全新的突破提升了碱基编辑的准确性、效率与安全性，拓展了碱基编辑工具的应用范围。但此时的碱基编辑技术还面临着一项全球科学家尚未攻克的重大障碍，那就是大规模的脱靶效应。

胞嘧啶碱基编辑器包括两个核心元件：识别目标位点的定位器（locator）——向导RNA（guide RNA），以及执行碱基替换的效应器（effector）——胞嘧啶脱氨酶。理想情况下，胞嘧啶脱氨酶应该仅在目标位点发挥作用，但由于其高结合活性，这种裸露在外的酶既能在guide RNA的介导下在脱靶位点产生脱氨反应（称作guide RNA依赖性突变），也可以在不依赖于guide RNA的情况下，在基因组DNA随机产生的单链区域进行脱氨反应（即guide RNA非依赖性突变）。这两种脱靶突变，尤其是后者很难被检测到，可能带来严重的后果。

为了解决脱靶的难题，陈佳教授团队最初的设计思路是将胞嘧啶脱氨酶拆成两部分，它们单独存在时不具备活性，只有两者结合才能进行脱氨反应，从而实现靶向编辑的目标。

但实际的实验结果却向研究团队泼了一盆冷水。他们将胞嘧啶脱氨酶拆开后，发现胞嘧啶脱氨酶的调节结构域成为了另一部分的抑制剂。回忆这段实验历程时，陈佳教授告诉我们，看到结果严重偏离预期，他当时也感到很难过。但他们很快意识到，这个意外出现的抑制剂，恰好可以用作胞嘧啶脱氨酶的“锁”，限制其在靶向位点以外的活性。

tBE的诞生：实现“零脱靶”

基于这一思路，陈佳教授团队与合作者开发出了名为变形式碱基编辑器（transformer Base Editor，tBE）的新型碱基编辑工具，并在2021年通过Nature Cell Biology期刊发表了这项突破性进展。

陈佳团队发现，自然界天然存在胞嘧啶脱氨酶的抑制剂，相当于给胞嘧啶脱氨酶上锁，同时避免了上述两类脱靶突变。当然，只有锁还不够。到达目标位点后，还需要解开这把锁，从而恢复脱氨酶的活性。为此，研究团队的策略是直接将锁切断。他们在抑制剂和胞嘧啶脱氨酶之间添加了一个蛋白酶的酶切位点，它可以在靶向位点处将锁切掉，达到了“解锁”的目的。

基于这一系列的设计，胞嘧啶脱氨酶仅在靶向位点处进行非常高效、精准的编辑，避免在脱靶位点处产生任何突变。

▲tBE的工作原理以及与Regular BE的对比（图片来源：Wang et al.，Nature Cell Biology，2021）

“一些特别关键的技术往往不是我们计划好的，而是偶然发现的。”对于这项最初源于意外的突破，陈佳教授谈到。

后续实验证实，对于guide RNA依赖性与非依赖性脱靶突变，tBE都完全实现了零脱靶。“我们的tBE消除了所有的脱靶，同时还能保证它非常高效的靶向编辑，这是一项非常不容易的成果。”

tBE的下一步

陈佳教授实验室的一系列碱基编辑工具已经申请、获得了多项国际与中国的专利授权。其中，tBE已经获得了美国、中国、澳大利亚等多个国家和地区的专利授权。据陈佳教授介绍，相对于现有的碱基编辑系统，tBE在临床治疗的应用范围得到极大的扩展。tBE既能搭配腺相关病毒（AAV）、脂质纳米颗粒（LNP）等多种体内递送方式，大幅提升体内的编辑效率；也能通过电转等方式在体外抽提的造血干细胞中进行高效的编辑。此外，tBE还可以结合CAR-T细胞疗法，在T细胞里进行双靶点甚至多靶点的高效编辑。

目前，tBE已经在临床应用中体现功效。例如，tBE对β-地中海贫血等罕见病已经展现出超过80%的高编辑效率，其中治疗β-地中海贫血的管线正在系统进展，相比于传统Cas9核酸酶基因编辑技术展现出更为优异的疗效和安全性。此外，利用tBE协助肿瘤免疫治疗、增强CAR-T疗效、治疗传染性疾病等管线的开发均在进行中，体现出靶向编辑效率高且无脱靶现象的优势。

“接下来，我们希望将tBE的理念应用到更多编辑工具中，在tBE之外开发出其他高精度的新型编辑器；另一方面，我们希望在递送方面实现突破，例如实现体内的组织器官特异性递送。”除了上述短期内希望看到的突破，陈佳教授还展望了更长远的未来：如果能实现长片段的定点插入、在指定器官内进行体内基因编辑，未来的基因疗法将迎来颠覆性的变化。

过去十年，基因编辑技术的发展改变了陈佳教授的研究方向，而他开发的工具正在进一步推动基因编辑的应用，为基因编辑的前景开辟出更多可能性。在陈佳教授看来，研究方向的变化改变了他的思维方式，使得他在好奇心驱动之余也会从疾病与临床需求的角度思考，寻找具有转化潜力的课题。而对于面临方向选择的年轻学生，陈佳教授也给出了自己的建议：关注自己的内心喜欢什么、保持open mind，为自己的科研生涯预留多几个选项。

参考资料：

[1] Wang, L., Xue, W., Zhang, H. et al. Eliminating base-editor-induced genome-wide and transcriptome-wide off-target mutations. Nat Cell Biol 23, 552–563 (2021). https://doi.org/10.1038/s41556-021-00671-4

[2] Komor, A., Kim, Y., Packer, M. et al. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature 533, 420–424 (2016). https://doi.org/10.1038/nature17946

[3] Wang, SW., Gao, C., Zheng, YM. et al. Current applications and future perspective of CRISPR/Cas9 gene editing in cancer. Mol Cancer 21, 57 (2022). https://doi.org/10.1186/s12943-022-01518-8

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