幽门螺杆菌（H. pylori）感染已被证明与慢性胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡、胃癌等胃部疾病的发生密切相关。多年以来，临床普遍使用以抗生素为主的三联或四联疗法对其进行治疗。但是，抗生素的使用不仅会带来诸多胃肠副反应，而且还容易使细菌出现耐药性。近年来，众多代替抗生素的新型疗法引起研究者关注。其中，声动力疗法（SDT）因其非侵入性、高组织穿透性、安全性等优点而受到青睐。SDT通过在超声下生成的活性氧（ROS）和机械效应来抗菌。然而，传统的声敏剂产生ROS的效率受氧气含量制约，难以在体内发挥最好疗效。
本研究构建了一种可以生成与氧无关的烷基自由基（R·）的纳米粒子（PtCu3-PDA@AIPH@Fucoidan，PPAF），以靶向杀灭H. pylori。表面修饰的岩藻依聚糖（Fucoidan）使PPAF具有良好的亲水性和呈现负电荷，有助于纳米粒穿透胃粘液屏障，同时能靶向H. pylori表面的岩藻依聚糖结合蛋白，提高杀菌效率。在超声刺激下，AIPH可以生成与氧无关的R• ，从而在H. pylori定植处的缺氧环境中发挥抗菌作用。在生成R•的同时，AIPH还可以产生氮气，从而增强超声空化效应，破坏细菌生物膜，促进纳米粒与细菌的结合。
图1 （a）PPAF的制备；（b）超声治疗H. pylori感染的治疗机制
通过粒径电位、TEM、XRD、XPS、FTIR、UV-vis等技术手段证明了PtCu3纳米晶体和PPAF纳米粒子的成功合成。PtCu3纳米晶体的水合粒径约为43 nm，电位约为46.23 mV；TEM表征尺寸约为6.86±1.63 nm；XRD图谱显示其结晶度高，且与PtCu3标准卡片图谱相吻合；XPS图谱证实了PtCu3纳米晶体中同时存在Pt和Cu。PPAF纳米粒子的水合粒径约为199.43±3.37 nm，电位约为-22.93 mV；TEM表征尺寸约为87.16±18.09 nm；XRD图谱显示其与PtCu3标准卡片相吻合，FTIR及UV-vis光谱结果均表明多巴胺的修饰、AIPH的负载、岩藻糖的包覆的成功，即PPAF纳米粒子的成功合成。
图2 PtCu3和PPAF的合成与表征。a, b)两种不同尺度下PtCu3纳米粒子的TEM图像。c) PPAF的TEM图像。d) PPAF的元素映射图。e) PPAF的水合粒径。f) 不同纳米粒的Zeta电位。g) FTIR光谱。h) XRD谱图。i) PtCu3的全谱和j) Cu 2p区。
接着，对PPAF纳米粒子的声动力性能进行考察，包括1O2、•OH、R•的生成能力。结果表明，1O2、•OH、R•的生成量与超声时间成正比，与PPAF纳米粒子浓度也成正比，PPAF纳米粒子具有良好的声动力性能。
图3 生成ROS和R•的检测。a) 超声刺激下1O2、•OH和R•生成示意图(由Biorender.com制作)。b) 超声作用下AIPH生成R•和N2的方程式。c) PPAF浓度为200 μg mL-1时，用DPBF探针在不同超声时间下检测1O2生成的紫外光谱。d) 不同PPAF浓度下在超声1分钟的条件下检测1O2生成的紫外光谱。e)不同组别与DPBF孵育5分钟，特征吸收峰的吸光度百分比。f) PPAF浓度为200 μg mL-1时，用MB探针在不同超声时间下检测•OH生成的紫外光谱。g) 不同PPAF浓度下在超声1分钟的条件下检测•OH生成的紫外光谱。h) 不同组别与MB孵育5分钟，特征吸收峰吸光度百分比。i) PPAF浓度为200 μg mL-1时，用ABTS在不同超声时间下检测R•的产生。j)不同PPAF浓度在超声1分钟的条件下检测R•的生成。k) 不同组别与ABTS孵育5分钟，特征吸收峰的吸光度百分比。
考察了PPAF纳米粒子穿透胃粘液层的能力。PPAF纳米粒子光滑的表面、合适的粒径大小、表面负电荷、良好的亲水性都为穿透胃粘液层提供了条件。在纳米粒子与粘蛋白的聚集率测试及粘液渗透测试中，15.48±3.65%的低粘蛋白聚集率以及在超声条件下90.26±3.00%的高粘液穿透率，直接证明了PPAF纳米粒子可以穿透胃粘液层，且超声可以生成额外的氮气，有助于增强纳米粒子的渗透，来应对体内胃部复杂的生理环境。
图4 PPAF的黏液渗透试验。a) PtCu3、PP、PPAF的静态接触角。b)渗透试验示意图。c)纳米颗粒-粘蛋白在粘蛋白溶液中的聚集率。d)穿透试验中不同处理组的荧光强度率(n=3， *p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001)。
首先，通过平板计数法和细菌活死染色证明了PPAF纳米粒子的抗菌效果随着超声时间的延长、PPAF浓度的增加而增加。然后对超声刺激PPAF纳米粒子杀菌的机制进行探索，结果如下：（1）PPAF纳米粒子具有靶向H. pylori的能力，可以与H. pylori的充分结合，有助于精准杀菌。（2）PPAF+US处理组的细菌，细菌表面会皱缩破裂，有助于细菌内容物（蛋白质、核酸）泄露，促成细菌死亡。（3）超声刺激PPAF纳米粒子ROS生成最多，有助于造成细菌氧化应激，促成细菌死亡。（4）N2的生成使PPAF纳米粒子与超声的联用可以进一步增强超声机械效应，有助于破坏细菌生物膜的完整性、根除生物膜细菌。
图5 PPAF的体外声动力抗菌能力。a)不同超声时间处理后的抗菌平板图。b)经PPAF和不同超声时间处理后H. pylori存活率。c) 不同PPAF浓度处理后的抗菌平板图。d) 经不同PPAF浓度处理后H. pylori存活率。e)不同分组处理后的H. pylori活/死染色图。f)图e中活/死染色图像的定量分析(n=3， *p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001)。
首先，通过脲酶检测法、平板计数法、H＆E染色法考察了超声刺激的PPAF纳米粒子在胃部对H. pylori的体内抗菌活性，证明超声刺激的PPAF纳米粒子对H. pylori感染的小鼠有良好的治疗作用，可以起到杀灭H. pylori的作用。
接着，用ELISA试剂盒探究了小鼠胃部炎症因子的水平，证明超声刺激的PPAF纳米粒子可以降低H. pylori感染小鼠的胃促炎因子IL-1β的水平，升高胃抗炎因子IL-10的水平，有助于调节因H. pylori感染导致的炎症环境。
然后，使用多光谱细胞体内定量及检测系统对PPAF在小鼠体内的分布进行成像分析，证明了PPAF纳米粒子可以有效靶向H. pylori，延长了在胃部的滞留时间。
图6。体内抗H. pylori研究。a)该图说明了幽门螺旋杆菌感染小鼠模型的时间表和实验步骤。b)各组治疗后胃H. pylori涂布平板图。c) b图的平板计数结果。d)脲酶检测各组治疗后H. pylori负荷。e、f)采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定小鼠胃组织中促炎因子(IL-1β)和抗炎因子(IL-10)水平。g)胃组织H&E染色(n=3， *p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001)。
图7 PPAF在小鼠体内的靶向作用。a) PP和PPAF灌胃后，不同时刻H. pylori感染小鼠的活体荧光图像。b) 灌胃2小时后小鼠主要器官的荧光图像(n=3)。
治疗结束后收集小鼠粪便，对小鼠胃肠道菌群进行分析。不同分组属水平细菌分布相对丰度直方图、OUT聚类韦恩图、Chao 1指数分析结果都表明抗生素的使用显著降低了物种丰度，而PPAF+US组与Uninfected组的各物种丰度更为相似。Shannon指数及Simpson指数分析结果表明PPAF+US组的微生物多样性水平与Uninfected组相似，没有显著差异，明显优于OAC组。主成分分析结果表明抗生素的应用导致小鼠胃肠道菌群组成与其它组的组成存在显著差异，而PPAF+US组的菌群组成与其它组更为相似。这些结果都证明PPAF纳米粒子较抗生素对肠道菌群更安全友好，不会造成肠道菌群稳态失调。
图8 不同治疗组小鼠胃肠道菌群的稳态分析。a)不同类群属水平细菌分布相对丰度直方图。b) OTU聚类的维恩图。α-多样性指数分析包括c) Chao 1, d) Shannon和e) Simpson。f)不同组间样本主成分分析(n=3, NS表示无显著差异，*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001)。
综上所述，本研究合成了一种基于SDT的PtCu3-PDA@AIPH@Fucoidan(PPAF)纳米复合材料，用于选择性治疗幽门螺杆菌感染。该纳米材料由多巴胺修饰的声敏剂PtCu3、烷基自由基生成剂AIPH和靶向幽门螺杆菌的岩藻依聚糖组成。在幽门螺杆菌感染微环境下，PPAF纳米材料可以有效地穿透胃粘膜、靶向幽门螺杆菌。此外，PPAF表现出优异的声动力性能，在超声刺激下产生ROS和不依赖氧的R•用于杀菌。同时，超声作用下产生的N2增强了超声空化作用，促进PPAF纳米颗粒对胃粘膜的渗透，而且破坏幽门螺杆菌生物膜的完整性，有助于细菌的根除。
文章以Mucus and Biofilm Penetrating Nanoplatform as an Ultrasound-Induced Free Radical Initiator for Targeted Treatment of Helicobacter pylori Infection为题发表在Advanced Healthcare Materials上。文章通讯作者为郑州大学药学院朱迎男副教授。
原文链接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/adhm.202400363
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