合作单位：Nanjing Agricultural University
参考文献：Ting Hu, Yun Xiang, Qifeng Chen, et al. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2020. DOI：10.1016/j.ecoenv.2020.111141（IF = 7.129）
背景：
乳氟禾草灵（Lactofen）是二苯醚除草剂的一员，主要用于保护农作物田免受阔叶杂草的侵害。然而，Lactofen的广泛使用可能导致作物、土壤和水中的大量残留，对生物体构成风险。因此，清除环境中Lactofen的残留是非常重要的。
Lactofen因其化学结构中含有一个手性碳原子而被归为手性除草剂。消旋-Lactofen由(S)-和(R)-对映体组成，Lactofen的大部分除草活性来自(S)-对映体。不同的手性除草剂异构体往往具有不同的环境行为。各种手性农药在土壤中的对映选择性降解已经被观察到。Lactofen在土壤中的对映选择性降解也有报道，结果表明(S)-(+)-Lactofen被优先降解，导致(R)-(−)形式相对富集。
细菌已被证明在去除环境中Lactofen残留物方面发挥着重要作用，Lactofen的生物降解通常是通过酯键的连续水解形成去乙基Lactofen，随后形成酸化Lactofen。酯键的断裂通常需要酯酶的参与，是Lactofen降解的关键初始步骤。因此，从Lactofen降解菌中寻找酯酶关键基因具有重要意义。
到目前为止，仅有LacE和LacH两种Lactofen酯酶被报道，并且这两种酯酶对Lactofen有对映选择性降解的现象，但其对映选择性降解的分子生物学机制尚不清楚。
方案设计：
本研究从Lactofen降解菌株Edaphocola flava HME-24中发现了一种新的酯酶LanE，其与酯酶EstD的同源性达到29.14%。LanE对Lactofen的催化效率高于已报道的酯酶LacE和LacH。经与魔德科技（www.modekeji.cn）技术团队沟通，模拟了LanE的三维结构，通过分子对接揭示了LanE对消旋-Lactofen的对映选择性降解分子生物学机制。
主要结果：
LanE酶蛋白与S/R-Lactofen的相互作用
为了进一步分析LanE酶蛋白与S/R-Lactofen结合的驱动力，本文对二者的相互作用模式进行了分析，如图1所示。从图中可以看出，S-Lactofen、R-Lactofen与LanE酶的结合构象基本相似，均结合在由Ser255-His432-Asp398构成的催化三联体附近。具体来讲，S-Lactofen结合在Ser173、Pro177、Gln178、Arg180、Lys188、His254、Ser255、Glu256、Gln400、Asn431、His432和Leu433组成的口袋中，两个酯基分别与His254和Glu256形成了氢键，硝基分别与Gln178和Lys188形成了氢键，而两个苯环之间的氧原子则与Gln400形成了氢键作用。催化中心的Ser255与羰基碳原子之间的催化距离为3.18 Å，具备较好的催化反应条件。
同样地，R-Lactofen结合在相同的口袋中，但由于手性构型的变化，甲基朝向Ser255，并导致末端酯基部分的构象发生变化，并与Gln178和Glu256形成氢键，而苯环之间氧原子的氢键消失。而催化中心Ser255与羰基碳原子之间的原子距离则增大到了3.90 Å。
综上，S-Lactofen和R-Lactofen均能够结合在LanE酶的催化活性中心，S构型与酶的亲和力略强于R构型。由于关键位置甲基朝向的变化，导致R构型中的酯基与催化关键氨基酸Ser255的距离增加，这可能使R构型相对于S构型更难发生催化作用。
图1 S-Lactofen（a和b）和R-Lactofen（c和d）与LanE酶蛋白的结合模式图（蓝色虚线表示氢键作用，红色虚线表示催化原子距离）
LanE酶催化Lactofen酯水解的作用机理推测
根据分子对接结果，并基于文献中对于该类酶催化机理的预测，本文对LanE酶酶催化底物S-Lactofen酯键水解的反应过程进行了推测，如图2所示。从图中可以看出，LanE酶催化的反应过程如下：S-Lactofen先结合到LanE酶的催化活性位点，催化中心Ser255羟基上的氢原子转移到His432上，形成氧负离子，并进攻羰基碳原子，形成C-O键；然后由一个水分子作为介质，His432上的H原子转移到水分子，水分子的H转移到末端的氧原子，断开S-Lactofen的C-O键，脱去乙醇分子，Ser255与S-Lactofen剩余部分形成酯键；最后在水分子的作用下，Ser255恢复初始结构，S-Lactofen形成最终产物羧酸，完成酯水解催化反应。由于S-Lactofen水解之后的结构仍然包含一个酯结构，因此该结构可能在活性位点调整结合构象并再次发生催化酯水解反应。
图2 LanE酶催化底物S-Lactofen酯键水解的反应机理推测（黑色虚线表示氢键）
本文采用分子对接方法研究了S/R-Lactofen与LanE酶的结合模式，并基于分子对接结果，对LanE酶催化S-Lactofen酯水解的反应机制进行了推测，让我们对Lactofen(S)-对映体在分子水平上的优先分解代谢有了理解，并可以说明已报道的Lactofen在环境中的对映选择性降解。