SUNS 丨基于高通量测序技术无创筛查双胎染色体非整倍体及胎儿游离DNA浓度分析

【实验方法】

1、选择达安健康临检中心做无创产前筛查的150 例中68例怀有男性胎儿的单胎样本作为对照组，217例双胎妊娠中的120例怀有男性胎儿的孕妇样本实验组进行分析，其中包括自然双胎67 例，辅助生殖技术植入的双胎47例，双胎消失综合征样本6 例。

2、用无菌的 EDTA 抗凝管采集孕妇外周血 10 mL。先 4300 rpm 低速离心10 min，将上清液转移到无菌的低吸附 Eppendorf 管内，接着 13 600 rpm，4℃，高速离心10 min，吸取上层血浆并分装到新的Eppendorf 管内，冻存于-80℃冰箱。

3、血浆游离DNA采用金麦格血清游离DNA 提取试剂盒（磁珠法）按照说明书进行提取。

4、文库构建采用Ion Plus Fragment Library Kit V3 和 Ion Plus Fragment Library Adapters Kit，并按照说明书操作。文库构建好后采用 Qu⁃ bit® 2.0 和dsDNA HS Assay Kit 测定浓度，用安捷伦的 2100 bioanalyzer检测 DNA 片段分布情况。

5、文库采用 Ion OneTouch™ 2 仪器进行模板制备，然后使用 Ion OneTouch™ ES 仪器进行阳性模板富集，接着采用 Proton 测序仪进行上机测序，试剂采用 Ion PI™ Sequencing 200 Kit v3，芯片为 Ion PI™ Chip v2，并按照说明书进行操作。

6、测序分析结果为染色体三体阳性的样本，告知孕妇三体高风险情况并征求孕妇同意下在医院进行羊水穿刺，并将穿刺物送第三方检测机构进行羊水细胞培养染色体核型分析。

7、测序数据经去低质量、去重复、GC 校正等处理后，根据类似文献报道的方法分别计算出 13 号染色体，18 号染色体和 21 号染色体的 Z 值，并以 Z 值＞3 判断为该染色体三体阳性。根据 Y 染色体唯一比对条数进行胎儿游离 DNA 浓度计算。采用 SPSS 19.0 软件进行结果统计，运用单因素方差分析比较自然妊娠双胎组、辅助生殖技术植入的双胎组、双胎消失综合征组和单胎妊娠组 4 组间胎儿游离 DNA 浓度、孕周、孕妇年龄和 Z 值的差异，P＜0.05 为差异有统计学意义。

【实验结果】

1、188 例样本按妊娠情况分成 4 组，其中自然妊娠双胎组样本 67 例，孕妇平均年龄为 30.39 周岁，平均孕周为 17.96 周；辅助生殖技术植入双胎组样本 47 例，孕妇平均年龄为 32.30 周岁，平均孕周为 17.64 周；双胎消失综合征组样本 6 例，孕妇平均年龄为 31.83 周岁，平均孕周为 16.33 周；自然妊娠单胎组样本 68 例，孕妇平均年龄为 31.51 周岁，平均孕周为 17.84 周；单因素方差分析结果显示，4 组间孕妇年龄间无显著性差异（F=1.124，P=0.341），孕周间也未见显著性差异（F=0.268，P=0.848）。

2、120 例双胎妊娠样本中，一共检出 2 例染色体三体阳性样本，阳性率约为 1.7%，其中一例为自然妊娠，测序结果为 21 三体阳性；另一例为辅助生殖技术植入的样本，测序结果为 13 三体和 18 三体阳性。阳性检出结果与后续的核型分析结果一致，具体情况见表 1。另外，病例跟踪结果显示，本次研究所检测的阴性样本中未出现假阴性的案例。

3、自然妊娠双胎组样本平均的胎儿游离 DNA浓度为 14.72%；辅助生殖技术植入双胎组样本平均的胎儿游离 DNA 浓度为 11.25%；双胎消失综合征组样本平均的胎儿游离 DNA 浓度为 11.51%；自然妊娠单胎组样本平均的胎儿游离 DNA 浓度为11.26%，见表 2。单因素方差分析结果显示，4 组间胎儿游离 DNA 浓度具有显著差异，F=13.864，P=0.000。组间两两比较分析显示，自然双胎妊娠组胎儿游离 DNA 浓度明显高于辅助生殖技术植入双胎组、双胎消失综合征组和自然妊娠单胎组，P 值均小于 0.05。而其他 3 组间胎儿游离 DNA 浓度无显著性差异（图1）。

4、单因素方差分析结果显示，自然双胎妊娠组、辅助生殖技术植入双胎组、双胎消失综合征组和自然妊娠单胎组4 个组间13 号、18 号和21 号染色体的Z 值均无显著性差异（F13=0.268，P13=0.848；F18=0.412，P18=0.744；F21=0.745，P21=0.526）。