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羊水培养后胎儿嵌合体的咨询（一）：真嵌合？假嵌合？

羊水培养后胎儿嵌合体的咨询（一）：真嵌合？假嵌合？ astraia胎儿医学软件
2022-02-10
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导读：｜GUIDE｜产前诊断中棘手的事情非常多，嵌合体的咨询是其一。 困难在于，没有照本宣科能解决的方法，如果不了

｜GUIDE｜

产前诊断中棘手的事情非常多，嵌合体的咨询是其一。

 

困难在于，没有照本宣科能解决的方法，如果不了解背后的知识，往往解决一些问题，制造一些（或更多）问题。

 

哪怕从事多年产前咨询，仍然在困局中，毫无头绪。

 

刘子建教授在打开胎儿医学的大门的一期公开课中讲了《胎儿嵌合体的咨询》，对于不熟悉嵌合体的产科/产前诊断的医生来说，需要反复聆听和思考才能更好地掌握及运用。

（文章末尾点击“阅读原文”可回放视频）。


我们尝试用公众号的文字来概括，希望对听讲座的医生们有些帮助。

 

聚焦于两个问题：

1.关于羊水培养后嵌合体的真嵌合（true mosaicism）和假嵌合（pseudomosaicism）的问题。

2.胎儿真嵌合体所代表的临床意义/严重性。


由于内容较多，这一期的文字内容关于羊水培养后嵌合体的真和假的问题。


01.

基础知识


1.什么是嵌合体？

来源于单个受精卵发育成的个体内含有不同遗传物质的组合。嵌合现象不一定在整个身体，也可能局限在一个组织，一个器官中，或不同的组织或器官中。

图片来源于网络

 
2.导致嵌合体的原因是什么？

可能是由有丝分裂过程中的错误引起的。如果有丝分裂出现了错误，一个细胞就不能均匀地分裂成两个细胞。例如：一些细胞有正常数量的46条染色体，而另一些细胞有更多(47)或更少(45)条染色体。

不论是常染色体或性染色体都有可能包含在内，受精卵开始分裂的过程中，可能会出现正常和不正常的细胞混合在一起的情况，一种是正常的，一种是带有多一个或少一个的染色体，或重新排列过的染色体，结果发育成的个体便是由混合形态的细胞组成。

3.嵌合体的种类

-染色体嵌合：非整倍体、多倍体、大片段缺失/重复（>=10Mb）、易位、倒位、环状染色体、等臂染色体
-UPD嵌合体
-CNV嵌合体
-SNV/Indel嵌合体

临床上遇到的＞90%是非整倍体的嵌合体，即多一条或少一条染色体：
-50%为性染色体异常；
-40%为常染色体异常；
-10%为标记染色体异常。
·染色体结构异常＜10%，如：大片段缺失/重复，易位，倒位，环状染色体。

4.羊水细胞的来源

羊膜、胎儿皮肤、肺、膀胱、消化道上皮细胞等。包含内胚层、中胚层和外胚层的细胞。

5.为了发现嵌合体，羊水培养后需要看多少个细胞？

非原位细胞培养方法：20个
原位细胞培养方法：15个

美国、欧洲及澳大利亚的指南推荐15-20个细胞。

灰色和红色圆圈表示携带不同遗传物质的细胞

在我们朴素的观念里，难道不是样本量越大，能看到的嵌合体越接近真实吗？国内确实很多实验室倾向于看更多数量的细胞，以免漏诊嵌合体。

然而看得越多越好吗？

刘教授举例这篇文章，它解答了“看多少个细胞能够把多少比例的嵌合体看出来”。


如果看15个细胞，有95%的信心把比例为19%以上的嵌合体看出来；
如果看20个细胞，有95%的信心把比例为14%以上的嵌合体看出来；

即使看100个细胞，也只能把嵌合比例为3%以上的嵌合体看出来，低于3%比例的嵌合体可能会漏掉。

事实上，无论看多少，也不能确保发现所有的嵌合体。
而要发现更低比例的嵌合体，意味着花更多时间，做更少的工作。

而从产前诊断的角度来说，需要找到一个平衡点，即多少比例的嵌合体会对人体产生显著的临床意义？产前是不是有必要排除比例低于15%的嵌合？

15-20个细胞是根据大量的研究和计算得出的比较合理的数量。

02.
羊水培养后真性嵌合体（true mosaicism）和假性嵌合体（pseudomosaicism）

1.假性嵌合体产生的原因及判断原理

在培养的过程中，正常的细胞可以变成异常细胞，相反，异常细胞也可能变成正常。

培养过程中正常细胞变成异常细胞

如何判断是真嵌合，还是体外培养的假像（in vitro artifacts）？

所有的指南中，均建议把羊水样本分成2-3份，独立培养。培养环境越独立越好（不同的培养箱，不同的培养基，不同的电路等），尽可能排除外界的干扰。

如果一个样本里出现嵌合体，需要看其他独立样本中是否也同样有嵌合体，如果没有，很可能是培养导致的假性嵌合。

只有一个独立样本出现嵌合体，假性嵌合的可能性大

如果其他独立培养的样本都有嵌合体，那么真性嵌合的可能性大。

两个或以上独立培养样本中均出现嵌合体，真性嵌合的可能性大

2.羊水细胞培养的方法：非原位法、原位法

非原位法（Non-in situ method）：先用培养瓶培养后，再把细胞拿到玻片上做核型分析。


用这个方法分析，如何判断嵌合体等真假？用level I，level II，level III区分。

Level I: 仅在一个培养瓶中发现的单个异常细胞，被认为是培养过程中人为造成的，为假性嵌合；
Level II: 两个或多个具有相同染色体异常的细胞，来源于单个培养瓶/培养物，几乎都是假性嵌合；
Level III: 两个或多个具有相同染色体的细胞，来源于两个或以上的原代培养瓶/培养物，非常有可能是真性嵌合。

只有III级，才考虑真性嵌合的可能性大（除非培养的条件不够独立）。

原位法（In situ method）：一开始样本就在玻片上原位培养，细胞不拿出来，培养后就在玻片上分析和观察。
与非原位法相比，原位法被认为在工作负荷方面提供了一些优势。


Level I：只有一个克隆里发现异常细胞，而其他都是正常的，认为是假性嵌合；
Level II:  两个克隆里都发现异常细胞，但从同一个培养液里来，认为假性嵌合的可能性大；
Level III:  在两个不同培养液里的克隆都发现两个或以上的异常，认为是真性嵌合的可能性大。

此外，在一个培养环境中培养（原代培养）后，再分开换几个培养环境传代（传代培养），传代后的样本不能认为是独立培养，因为其来源是一样的。

 03.
关于羊水嵌合体的几个文献

1、美国一项较早的研究，邀请全国150个产前细胞遗传实验室参加研究，其中59个实验室提交数据。有超过60000个羊水样本的数据，绝大部分实验室常规观察20个细胞，对于发现嵌合体会用至少2个独立培养瓶/培养物的细胞做确认。

这篇文献能回答我们几个问题。

不同级别的羊水嵌合体的发生率：
level I：2.47% （72.2%）
level II：0.7%（20.5%）
level III：0.25%（7.3%）
在合格的细胞遗传实验室，III级嵌合，即我们认为的真性嵌合，在所有发现嵌合的比例只有不到10%，超过90%是假性嵌合。

在level I 和level II 嵌合体中，也就是我们通常认为的假性嵌合体中：
非整倍体占50%，其中， 2号染色体嵌合:占20-30%。
染色体结构异常占50%。


而在真嵌合体中，染色体结构的异常不到10%。

由上述数据得出，细胞培养后出现以下嵌合体更倾向于假性嵌合：
（1）染色体结构异常；
（2）2号染色体三体嵌合。

level I、level II被认为是假性嵌合的情况下，是否会漏诊真性嵌合？

这个研究由于是回顾性分析，只有大概70%的随访数据。可以看到，在754例中仅有2例是假阴性（也就是真性嵌合），概率为1/300.
因此，把I级和II级嵌合当作是假嵌合的情况下，是会漏诊真嵌合，但是比例非常非常低。

在这个研究中III级嵌合有异常表型的比例如何？

185例III级嵌合体，有异常表型的比例如下：
性染色体最低：11%
标记染色体次之：18%
常染色体最高：38%

通过流产物及活产的再次细胞学检测，确认的比例如下：
性染色体最高：86.8%
标记染色体次之：81.3%
常染色体最低：52.8%。

由于活产儿的染色体确认通常是用外周血，也说明了用血液标本复核羊水嵌合体会有较大偏差。


2、1992年另外一篇文献关于不同级别嵌合体的发生率：
不同类型嵌合体的发生率

结果表明：
Level I 的假性嵌合，在不同的研究中差别较大，从2.5%-7%不等。对于大部分实验室，这个概率约2-3%。如果太高，可能是实验室的培养有问题，或检测的问题，如：看的细胞数量过多。
Level II 的假嵌合大概1%以下。
Level III 的真性嵌合比例约0.25%，因此在产前诊断的羊水标本中是非常少的。

假如一个产前诊断中心一年有1000例羊水的样本量，实际上仅会有2-3例嵌合体发生。如果比例过高，需要在培养和检测环节找原因。

此外，前面说过，level I和level II里的染色体结构异常占50%，而真嵌合小于10%，因此在level I和level II里发现的染色体结构异常嵌合体中，大部分是假嵌合。

3.另一篇文献通过脐带血确认羊水诊断的常染色体嵌合体，总体符合率仅有13%。


该文献说明在产前诊断中，不适合用脐血复核嵌合体，对于性染色体嵌合可能有一定价值，但对常染色体嵌合的价值有限。

04.
小结

实验室：应该常规判断真的或假的嵌合体，包括一开始数多少细胞，多少个独立的培养基，看多少个细胞，与临床医生沟通等。每个学会的指南都有详细的内容，之间会有些差异，但是基本原则是一致的。

临床医生：需要对基本原理有足够的理解，当遇到嵌合体的报告，你如何向实验室问有意义的问题，包括培养方法，嵌合级别等。

广东省精准医学应用学会团体标准：需详细分析后，确定为I级嵌合体的，无需报告；确定为II级嵌合体的，一般无需报告（除非胎儿发现畸形）。


题图来源：https://www.invitra.com/

文章图片：刘子建教授《打开胎儿医学大门第21期：胎儿嵌合体的遗传咨询》视频

参考资料：

1.刘子建教授《打开胎儿医学大门第21期：胎儿嵌合体的遗传咨询》

2.广东省精准医学应用学会团体标准《染色体嵌合体的产前遗传学诊断与遗传咨询》

3.Am J Hum Genet. 1977 Jan;29(1):94-7. 

4.Prenatal Diagnnosis. Spring 1984;4 Spec No:97-130. 
5.Acta Obstet Gynecol Scand. 1994 Feb;73(2):119-22. 
6.Prenatal Diagnnosis. 1992 Jul;12(7):555-73. 




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【声明】内容源于网络
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