分析系列
第06期
Teasdale方法分享——基因毒性杂质：多评估，少检测
✎ 作者：合全药业原料药早期项目工艺分析部（常州）
✩ 感谢：合全药业原料药早期项目工艺分析部（常州）张楠、李叶、蒋竞、鲍华军、朱小红等人对本文的贡献
小分子药物的化学合成过程，通常需要用亲电试剂去构建药物分子骨架，而部分亲电试剂可能与DNA反应，即使在含量很低的水平，也有引发癌变的风险，这样的杂质称之为潜在基因毒杂质（Potential Mutagenic Impurities, PMI）。而上述试剂在合成工艺中广泛应用，完全避免PMI在药物中存在较为困难，目前通用的做法是基于安全限度的概念将PMI控制在可接受范围内，即不产生患者服药安全风险，具体可参考ICH M7（比如：TTC，LTL，AI 或PDE）。
由于PMI控制的限度较低，所以相较常规分析方法开发存在难度。如果还存在样品基质干扰或杂质本身没有响应的情况，PMI分析方法开发则更具挑战性。
那么在分析方法开发时所面临的挑战，都需要花时间精力去解决吗？我们认为不一定。在实际工作中遇到过许多案例，比如化合物不可能残留在产品中（工艺中会被除去），但由于杂质被评估为PMI而被要求开发一个检测方法，其实这是不必要的。
可避免PMI控制的策略
在ICH M7 Section 8中，明确指出了4种用于控制原料药中PMI的控制策略，其中Option 4 （见下图）就是基于对PMI性质和合成工艺的了解，评估PMI在工艺中的清除情况，在充分说明其残留量会低于接受标准的情况下，可用评估策略代替方法开发和检测。
图片来源：ICH M7
这给我们一个很好的启示，对于可能存在的、明确的PMI，我们应先选择Option 4的评估策略。若评估结果有利，就无需开发相应的方法；若一个合成路线中，存在多个PMI的情况，部分被评估通过，那么分析人员便可以把精力集中在真正有残留风险的杂质控制上。
一种可替代性评估策略：Teasdale方法
如果采用评估策略，具体如何进行？ICH M7也给出了参考方法，即基于被评估PMI的理化性质和整个工艺参数的深入理解，计算PMI在工艺路线中的清除因子，与实际需要的清除因子做比对，从而判断是否能被清除。关键的评估参数包括：PMI的化学活性，溶解性，挥发性，离子化特性，以及可清除杂质的物理操作（如制备色谱、大孔树脂吸附等）。这种半定量的评估方法由Andrew Teasdale等人在2010年首次提出，称Teasdale方法。
Teasdale方法定义了上述关键参数需要在评估过程中被考量，并设定了各参数对清除率的贡献值，具体如下：
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Physicochemical parameters |
Purge factora |
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Reactivity |
highly reactive = 100 moderately reactive = 10 low reactivity/unreactive = 1 |
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Solubilityb |
freely soluble = 10 moderately soluble = 3 sparingly soluble = 1 |
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Volatilityc |
boiling point >20 °C below that of the reaction/process solvent = 10 boiling point within ±10 °C of that of the reaction/process solvent = 3 boiling point >20 °C above that of the reaction/process solvent = 1 |
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Ionisability |
ionisation potential of GTI significantly different from that of the desired producedd |
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Physical processes: chromatography |
chromatography: 10−100 based on extent of separation |
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Physical processes: e.g. other scavenger resins |
evaluated on an individual basis. |
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aPurge factor = concentration before purging/concentration after purging. bThis relates to solubility within the context of a recrystallisation process whereby the impurity in question, if highly soluble, will remain within the mother liquors and hence be purged from the desired product. cThis refers to the deliberate removal of a solvent through solvent distillation or solvent exchange. dThis relates to a deliberate attempt to partition the desired product/GI between an aqueous and organic layer, typically achieved through the manipulation of pH to change the ionised/un-ionised state of one of the components. |
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表格来源：参考资料[1]
反应活性代表化合物与其他物质的反应能力，PMI越易与其他物质反应，表明该物质在工艺中越易被清除；
溶解性与结晶操作相关，当PMI在母液中溶解性高，需要被分离的固体产品就可以通过过滤操作与PMI实现有效分离；
挥发性主要与反应温度有关，当PMI沸点低于工艺中操作温度20℃以上，杂质可因自身挥发性而被移除；
离子化性质主要与化合物自身是否有酸碱基团有关，可通过调节pH进行酸提碱沉或碱提酸沉等操作，使杂质与被分离物进入不同的相，从而达到分离纯化的目的；
物理除杂操作，比如制备色谱，利用树脂吸附除杂等。
为了更好的理解如何应用该方法，我们可以举一个例子：
案例来源：参考资料[1]
路线中二氯亚砜是参与反应的试剂，也是PMI。由于其反应活性高（与标蓝化合物反应），因此在前三步反应中，反应活性均可设为100。由于溶解性较好（在标绿的溶剂中溶解度高），在成盐、萃取、结晶等操作中均可与被分离物质有效分离，因此4步反应中，溶解性参数均可设置为10。又由于二氯亚砜沸点79℃，在第1步和第4步的高温烘干操作中，会被有效分离，因此挥发性参数设为10。之后，将所有评估参数的数值相乘，就可预测理论的总清除因子1012。
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Step |
Reactivity |
Solubility |
Volatility |
|
1 |
100 |
10 |
10 |
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2 |
100 |
10 |
1 |
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3 |
100 |
10 |
1 |
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4 |
1 |
10 |
10 |
假设某药物需要长期服用，剂量为150 mg/day，那么基于TTC获得的可接受标准AI=1.5μg/day/150 mg/day=10 ppm。由于二氯亚砜是参与反应的原料，所以初始引入水平是100%（1,000,000 ppm），那么实际需要的清除率=1000000 ppm/10 ppm=105，通过对比理论清除因子和实际需要清除因子发现，理论预测远大于实际，也就是说二氯亚砜由于其自身性质会在现有的操作工艺中被除去，残留在API的可能性极低，因此无需开发方法监控。
目前Teasdale方法被不断证明，具有可操作性，且预测值相对保守，一般不会高于实际检测值，所以成为了一个较好的评估工具。基于Teasdale方法的评估理论，结合计算机辅助评估软件（Mirabilis）不断充实的数据库和更标准的评价体系，也将进一步方便用户使用。
结论
对于基因毒性杂质的控制，当合成路线基本确定的情况下，评估PMI可能的清除情况后，基本无残留风险的PMI可参考ICH Option 4进行控制。本文也建议了一个日趋成熟的方法——Teasdale方法结合其对应的 Mirabilis 软件的应用，能达到多评估、少检测，从而降低原料药工艺开发的技术挑战并节省整体的研发时间。
参考资料
[1]：Teasdale A., Elder D., Chang S-J, Wang S, Thompson R, Benz N, Sanchez Flores I, (2013). Risk assessment of genotoxic impurities in new chemical entities: strategies to demonstrate control. Org Process Res Dev 2013,17,2,221-230.
[2]：Burns M., Ott M., Teasdale A., Stalford S., Antonucci V, Baumann J-C, Brown R(2019). New Semi-Automated Computer-Based System for Assessing the Purge of Mutagenic Impurities. Org Process Res Dev 2019,23,11, 2470-2481
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