流式细胞术是一种先进的激光光电分析技术,可以针对悬浮在液流中的细胞，快速、定量和多参数地检测其大小、内部复杂结构、多种分子标记的表达水平等特征,从而对细胞的功能状态和生物学过程进行深入了解,在免疫学、肿瘤学、干细胞研究等多个生命科学领域具有重要应用价值。
抗原抗体特异性结合染色是流式细胞术将特定细胞群功能，具象化的重要手段。在流式检测领域中，我们常提及外标、内标。这些术语就是抗原表达位置不同，而衍生出的叫法。
外标即抗原表达在细胞膜上，包括各种膜蛋白、糖蛋白和糖脂等分子。如T细胞和B细胞膜上的CD分子、肿瘤细胞膜上的肿瘤相关抗原等。内标就是抗原表达在细胞质或细胞核中，包括一些功能蛋白、结构蛋白等，如颗粒酶、干扰素、细胞周期蛋白。
不同类型的抗原对应不同的细胞功能和生理病理状态,在疾病诊断、分子标记、药物靶点等方面具有重要意义。相较于外标，流式抗体内标的检测步骤更加复杂。在流式细胞术实验中，内标抗体染色的质量对实验结果的准确性和可靠性至关重要。
内标抗体通常用于识别和量化细胞内的特定蛋白质，因此内标抗体染色的优劣直接影响到实验的灵敏度和特异性。固定剂和破膜剂在染色过程中的选择和使用对染色效果有重要影响。
固定剂/破膜剂/刺激剂
临床中应用流式细胞术结合胞内染色技术检测T细胞、NK细胞功能是近年来发展起来的一项新技术，可在单细胞群水平评估其活性、功能，而内标抗体的染色质量直接影响流式细胞术数据的准确性。细胞刺激剂、细胞固定剂和细胞破膜剂是影响流式结果的关键“三剑客”。
注意事项
1) 固定和破膜的顺序：通常是先固定细胞，再使用破膜剂透化细胞膜。但在某些情况下，顺序可能需要调整，具体依赖于实验的要求和目标抗原的性质。
2) 固定时间和浓度：固定剂的作用时间和浓度需要优化，过度固定可能掩蔽抗原表位，影响抗体结合[2]；固定不足则可能导致细胞结构不稳定，影响结果。
3) 破膜剂的选择和浓度：选择适合目标抗原和实验条件的破膜剂，并优化其浓度和作用时间，确保有效透化细胞膜而不过度破坏细胞结构。
4) 固定和破膜剂的兼容性：确保选择的固定剂和破膜剂之间相互兼容，不产生不良反应。
中科同勉（下文简称TM）是一家围绕抗原、抗体等功能性蛋白进行技术研发和产品开发、生产、销售于一体的高新技术水平的生物医药企业。自主研发的流式抗体受到流式老师高度认可，而性能优异的辅助试剂是保证流式结果准确可靠的必要条件。现对其流式检测的辅助试剂与外企的标杆产品进行评测，评估其性能。
评测对象 |
商品化细胞固定剂、刺激剂、破膜剂（某进口品牌vs中科同勉） |
评测方法 |
同一志愿者全血，采用单一变量原则，根据厂家说明书进行操作，分析不同厂家细胞固定剂、刺激剂、破膜剂对流式最终检测结果的影响。 |
评测指标 |
FSC-SSC、IFN-γ（CD4+ T）、IFN- γ（NK） |
2. 数据对比
NK细胞在正常静息状态下，其产生IFN-γ的能力是较低的[1]。体外检测需要我们使用刺激剂来激活，检测结果显示两种刺激剂均能充分刺激NK细胞产生的IFN-γ。
两种固定剂在细胞的物理分群上无差异，同参数条件下，TM固定后，CD3标记的阳性群与阴性群分群较某进口品牌更明显。
相同检测参数条件下，TM破膜剂对人免疫细胞更加温和，能够较好的保持细胞的完整形态。
上述评测均使用TM自研抗体，验证样本n＞10。
3. 综合评价
细胞固定剂、刺激剂和破膜剂是用于流式细胞术检测中重要的辅助试剂，这些试剂的性能直接影响检测结果的准确性和可靠性。
通过严格的质量控制，TM自研生产的固定剂、刺激剂和破膜剂在人外周血样本检测中表现出了与国外知名流式试剂公司产品相当的性能。这不仅体现了国内试剂研发生产技术的进步，也为临床诊断和科研工作提供了可靠的国产化替代品，提高了检测的可及性。
1.Vivier, E., et al., Functions of natural killer cells. Nature immunology, 2008. 9(5): p. 503-510.
2.Yerpasheva, D., et al., How fixation affects the results of lymph node immunophenotyping by flow cytometry. Journal of Clinical Medicine of Kazakhstan, 2023. 20(5): p. 47-54.
3.Chen, S., et al., The Self-Specific Activation Receptor SLAM Family Is Critical for NK Cell Education. Immunity, 2016. 45(2): p. 292-304.
