2022年5月11日/医麦客--星耀研究院新闻 PharmaBIGStar News/--上文浅析了我国iPSC上下游产业链的状况，目前iPSC产业链尚未成熟，仍处于起步阶段。而iPSC具有低免疫原性、无限增殖潜力、易于进行改造等优势，提升了业内人士对iPSC发展前景的期待。然而，在iPSC的研发与应用中还面临着很多实际问题。
多方位挑战，多样化应对
异质性
尽管iPSC都具有多能性和无限增殖的潜力，但不同细胞系的形态、生长曲线、基因表达和分化成各种细胞谱系的倾向均不相同，加之培养过程中有可能存在的刺激因素，给应用带来了障碍。
研究发现，只有来自129种品系小鼠的mESC具有较好的产生嵌合小鼠并进行生殖系传递的能力，而在这一过程中，基因遗传及表观遗传因素共同影响着ESC的异质性。同样的，在人类的iPSC中也存在着异质性，已大量研究表明遗传背景是决定基因表达异质性的最大因素。不仅如此，有的iPSC已被证实存在分化能力缺陷。在神经分化中，大部分的iPSC形成Pax6阳性细胞的效率超过95%，少部分分化效率为80%，同时残留一部分未分化细胞。
为了克服异质性，研究人员试图将hPSC的“启动”状态转换为“初始”状态。已经有多种诱导hPSC转变为初始状态的方法被报道，如使用生长因子的化学抑制剂组合，过表达NANOG和KLF2转录因子等。不过，这项技术有可能导致染色体异常或印迹丢失的问题，目前尚在探索中。
致瘤性
在日本Masayo Takahashi团队成功将iPSC来源的视网膜色素上皮细胞移植到了一名患者的右眼中后，正准备进行第二例手术时意外发现了在患者的iPSCs和RPE细胞中存在两个微小的基因突变；2015年，山中伸弥报告称，第二例患者所培养的iPSC细胞有六个基因突变，包括一个与癌症相关基因，尽管该基因突变并不直接致癌，但这也使得临床研究更为谨慎。
主要有三种致瘤情况：(1)人PSC分化最终产物中存在未分化或未成熟的细胞，则可能由于错误模式形成导致畸胎瘤或肿瘤；(2)重编程因子在iPSC中保持活性可能诱使肿瘤发生；(3)iPSC培养过程中发生的基因突变引发肿瘤。
而降低致瘤风险的方法有建立有效的体外定向分化方法，并且形成更严格的纯化程序，来满足临床试验设定的安全标准要求。Masayo Takahashi团队首例临床试验中，iPSC衍生产品纯度保持95％以上，且几乎没有细胞表达未分化细胞的标志物，最终患者得以重见光明。
其次，重编程因子c-Myc是人类癌症中最常见的突变基因之一，通常起驱动作用。已有研究表明，通过逆转录病毒转染四个重编程因子而诱导产生iPSC形成的嵌合小鼠常常会形成肿瘤。因而，目前在重编程过中，有更多的重编程因子如RARg、LRH1、ASF1等被应用，也将致癌基因c-Myc替换成非致癌基因L-Myc和调控基因Lin28，并且正尝试利用除病毒介导以外的技术来完成重编程过程。
免疫原性
免疫排斥一直以来是细胞治疗中都不可避免的关键问题。自体iPSC的免疫原性较低，但基因异常表达仍有可能导致免疫排斥，这一现象在小鼠试验中曾被报道。并且，从时间和价格的角度考虑，同种异体“现货型”iPSC性价比或许更高，但这同时也带来了免疫原性问题。
人群中有些特殊个体的HLA基因5位点为高频单倍体的纯合子，来源于这些供体的细胞在细胞移植时能覆盖高数量的受体人群，这一类人也被成为“超级供体”。针对“现货型”iPSC免疫原性问题，建立一个“超级供体”干细胞库已成为发展的必要支持。目前，我国也已经建立了可覆盖约14%全国人口的超级干细胞库；并且不少企业也已经建成了独有的干细胞库用于研发和筛选。
此外，随着近年来基因编辑技术的发展，“HLA隐藏”已经诞生，可通过删除B2M基因而使HLA-A、HLA-B、HLA-C等I类MHC失活。不过这有可能导致iPSC缺乏I类MHC而被自然杀伤(NK)细胞裂解，研究人员尝试引入HLA-E和B2M组成的嵌合分子来避免激活NK细胞。目前，这种方法仍在继续完善中。
生产工艺与自动化
iPSC的生产工艺较复杂，从获取材料、重编程到扩增、分化再到检测、储存，每一环节均引入了不确定性。而当在大部分原材料是活细胞的情况下，工艺涉及大量的手动干预，将可能导致细胞质量的波动，从而给CMC带来极大挑战，这也是目前大规模生产面临的主要阻碍之一。
这要求为iPSC开发一个可重复、稳定性高的生产过程。目前，自动化尚不能全程取代手动，从手工处理到自动化处理的转换仍在研发中，许多细胞培养中的参数已被用于优化细化的生产过程。如已有研究表明，弗劳德数可以用来预测接种过程中振动后细胞的异质性。且现今已经研发出了全自动干细胞培养设备，可以实现iPSC全自动化培养、实时监控，更快速可靠得到稳定的最终iPSC细胞和相关的数据。
尽管要开发出高成功率且可以有效放大的生产工艺，同时还要经得起不同地理环境和生产场地的验证，目前暂无捷径可走，但提早布局自动化这些前沿技术可以有效提升工艺的稳健性，并解放出更多的人力。
配套的材料及设备
在iPSC生产过程中需要用到很多试剂及生产设备，但目前大部分依赖于进口，并且部分试剂仅是科研级，而药用级试剂对整个GMP质量体系、原材料质控等有着很高的要求，国内相关的配套产业尚待完善。而依赖于进口建立的iPSC研发或将掣肘于外国，遭遇“卡脖子”问题；此外，从产品的可及性角度来看，原材料过程化势必能够减少生产成本从而降低价格。同时，从整体角度而言，全球的上游产业仍处于初期阶段，国内与欧美存在差距但并不大，这也是发展国产化供应的一个机遇。
目前，国内iPSC需要一个完善的供应链，为产品开发提供及时和可靠的支持，也能为快速建立稳健CMC奠定基础。
临床试验与上市速度
iPSC也逃不开生物医药行业的“双十定律”，尽管各方都期待候选药品能够加速推进，然而临床试验进度十分漫长。以国外为例，I期试验到BLA批准通常需要7-10年，早期研发、临床投入及生产基地投入或许需要$800M–$1B。并且在2020年有75%的细胞与基因疗法由于CMC相关问题被推迟，平均延迟9个月，这也耽误了总体速度。
而为了解决这一问题，在早期需要聘请CMC专家，建立全面的反馈机制；同时，需要建立现代化的数据管理技术，并对临床试验的每个环节进行实时监测和闭环数据反馈；此外，需要提早为各期试验做好规划，以顺利推进临床试验和最终的审批。
监管
由于iPSC产品的复杂性以及该领域技术的快速革新，势必要求法规和监管层以更快的速度调整和适应行业的发展。目前，中国已经出台多项干细胞领域的相关政策，如《干细胞临床试验研究基地管理办法(试行)》、《干细胞临床研究管理办法(试行)》、《人源性干细胞及其衍生细胞治疗产品临床试验技术指导原则(征求意见稿)》等，从干细胞的药物研发转化到临床应用的全流程，已逐渐形成一系列的法规依据。同时，这也释放了一个信号即对iPSC“宽严相济”，对iPSC的发展持包容支持态度，而对相关的审查则更为严谨。
指导原则的出台，一定程度上提高了行业门槛和监管力度，有利于拥有核心技术的企业快速发展。而企业也需加强与监管部门的沟通，一起在iPSC领域“摸着石头过河”，尽量提前解决所存在的问题以加速国内iPSC的发展。
此外，iPSC领域还面临着诱导效率低、操作难度大、产业化人才不足等挑战。
总结
总体而言，iPSC在细胞治疗及其他领域的应用有着巨大的潜力。然而，iPSC作为新兴的技术发展尚不成熟，面临着诸多挑战，但挑战的背后也往往意味着机遇，相信随着研究的深入与技术的革新，iPSC领域面临的挑战终将被不断创新的方法克服。当今国内iPSC领域局势未定，“逐鹿群雄”谁能“问鼎中原”，我们拭目以待。
1.https://www.aisoutu.com/a/1612136
2.ShinyaYamanaka.Pluripotent Stem Cell-Based Cell Therapy—Promise and Challenges,CellStem Cell(2020) doi:10.1016/j.stem.2020.09.014
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