2022年8月18日/医麦客--星耀研究院新闻 PharmaBIGStar News/--国外AAV基因疗法已取得了不错的商业化进展，已有4款AAV基因疗法药物获批上市。但国内也紧随其后，截止目前，已有近20项AAV基因疗法申请或已获批临床试验。在上一篇中，我们详细了解了AAV上游培养三大环节面临的挑战和优化策略，接下来让我们走进AAV工业化生产下游一探究竟！
AAV生产下游流程主要包括：细胞裂解与澄清，病毒载体纯化（捕获纯化、精细纯化、超滤浓缩等），配方/罐装，质量检测。
上游三种生产方式得到的AAV颗粒都需要进一步纯化，涉及的工艺复杂，需要考察产品相关杂质、过程相关杂质的去除效率。下游处理步骤占病毒生产总成本的很大一部分，且难度很大，特别是纯化过程，因此有效地制备高纯度病毒的方法很重要。
难度较大的原因之一是：有超过100种不同的变体AAV衣壳，不同血清型的AAV蛋白存在差异。因此，各种血清型的不同表面特性无疑增加了AAV纯化难度。原因之二是：针对工艺和产品相关的杂质（包括宿主细胞物质，DNA和空衣壳），缺乏一个有效和可重复的平台检测方法，尤其是从空衣壳中分离出来的完整衣壳。
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下游纯化环节流程及优化策略
AAV下游工艺的主要目的就是从上游工艺产生的原液中纯化出活性成分，以使终产物达到一定的纯度水平，以确保其有效性，并降低患者的安全性风险。
下游工艺成本大概占据了总成本的60%左右，因此，一种高效、可重复的下游生产工艺流程显的尤为重要。下游工艺中面临的主要挑战有：细胞裂解、微滤及层析纯化，其中，最大的挑战当属于在层析纯化过程中针对AAV空壳病毒的去除。除了后期通过纯化工艺去除空壳AAV之外，优化上游的生产工艺也可以实现空壳率的降低。
由于AAV是20-25nm的二十面体，相对较小，相比其它病毒，非常稳定，所以对于下游工艺来讲，其有两个显著的优势：首先是载体可通过0.2μm过滤器除菌过滤，便于控制产品的无菌性；其次是AAV可耐受大多数严苛的条件，如剪切、pH变化以及高电导缓冲液等。
近些年，研发人员开发了多种AAV下游纯化方法。典型的纯化流程包括以下6步：
一、细胞裂解
早期对AAV载体的研究通常使用AAV2血清型，在这种血清型中，病毒颗粒释放进入培养基的量是有限的，需要裂解细胞才能得到产物。
裂解方法包括机械法和化学法，小的实验室规模制备常常采用反复冻融、超声处理等方式，而大规模的生产制备，常采用化学法（表面活性剂、有机溶剂等）破碎细胞，将病毒载体从细胞中释放出来；
反复冻融方法在实验室小规模AAV载体制备中常用，但是难以扩大用于AAV规模化生产。机械均质法，该方法可以使细胞膜在高压剪切力作用下发生破裂，并释放出AAV，虽然这种方法可应用于AAV规模化生产，但由于其剪切力引起的聚集和沉淀往往会导致产品损失。
其中，采用表面活性剂TritonX-100作为细胞裂解的方法在AAV病毒载体纯化过程有较多的采用（其他方法包括高渗溶液），研究证明这种方法是有效的，且成本不高，很容易应用于AAV的规模化生产中。
但根据最近的研究显示，TritonX-100处理过的病毒制品会导致一些诸如导致眼睛损伤、口腔毒性及皮肤刺激等生理毒性，随之在2016年被欧洲化学品管理局（European Chemicals Agency）列为需高度关注的物质(SVHC)。
因此，针对AAV工艺中的细胞裂解过程，现有方法的优化或是新方法的开发就显得尤为重要了。为了解决这个顾虑，Cytiva公司曾提供过一个解决方案：使用0.5% Tween®20+ 20U/mL Benzonase+1mM MgCl2的配方，在生物反应器中37℃培育4h，并充分混合，可在不影响细胞裂解效率的同时，有效降低生理毒性。
此外，研究人员也正在寻找合适的替代药物。例如，Tween®20与Triton X-100 相比，表现出了相当的合适性能，但存在对下游层析单元操作影响的潜在担忧。而使用酸性缓冲液进行细胞裂解，如pH为4.2的柠檬酸盐，可能可以作为一种替代型去污剂，研究表明其可以减轻对下游单元操作的影响，并消除验证去污剂清除的需要。
柠檬酸复合二价离子和低pH值可能可触发病毒衣壳蛋白蛋白酶活性，这有助于AAV载体的释放。此外，使用柠檬酸等酸性缓冲液裂解细胞可以促进AAV释放，且污染更少。
二、去除游离核酸
由于裂解细胞后，细胞内的宿主DNA、RNA及其它游离DNA等核酸被释放了出来，需要用核酸酶将这些核酸杂质消化去除，在去除这些杂质的同时，也会进一步降低细胞裂解后料液的粘度，有利于后续的纯化过程。
细胞裂解后产生大量的细胞碎片，很难通过传统死端过滤的方式去除，而切向流过滤（TFF）技术则是利用泵推动流体通过滤膜表面，冲刷去除其上面截留的分子，从而使滤膜表面的积垢程度降至最低。于此同时，切向流体也会产生垂直于滤膜的压力，推动溶质和小分子通过滤膜，利用该方法进行生物分子分离，效率更高，浓缩或渗滤速度更为快捷，同时可有效避免堵塞的发生，在AAV下游工艺中得到广泛应用。
此外，在微滤过程中，剪切力过大会导致AAV颗粒聚集或失活，而中空纤维材料可以有效减少剪切力的产生，在AAV生产中具有明显优势。
在细胞裂解和酶处理后，收获的物料将是高度混浊的溶液，其中包括AAV颗粒以及与工艺相关的杂质(如DNA、蛋白质、培养基成分和细胞碎片)。工艺相关杂质的去除通常通过离心和/或过滤的结合来进行，目的是在随后的层析单元操作之前，使杂质和颗粒的挑战最小化。优化的收获步骤将有助于提高产量，还可能可提高层析填料的使用寿命，并降低对层析介质所需严格清洗方案的要求。
三、料液的澄清
一般在进一步纯化前需要对细胞裂解后的料液进行澄清，往往是通过离心或膜过滤等方法去除细胞碎片等杂质。离心和膜过滤在实验室规模下都很方便，但对于50-2000 L料液的澄清，一次性使用的深层过滤是大部分情况下的首选方法，以尽可能降低硬件设备投入成本，并便于规模放大。
虽然不锈钢离心机也适用于大规模生产，但其可清洁性和操作人员因气溶胶形成而面临的暴露风险是需要考虑的关键因素。另外，尽管市面上存在一次性使用离心设备，如Ksep和Unifuge，但两者规模选择均有限，并可能增加开发时间。一次性使用技术降低了设备的初始投资成本，减少了用水，并降低了交叉污染的风险。
此外，这些技术通过降低清洗和清洗验证的需要，而降低产品轮转时间，这允许在给定的时间框架内增加生产次数或缩短多个程序之间的时间。这可增加整个工厂的利用率和灵活性。此外，由于上述原因，大多数CDMO可能只有可进行一次性使用操作的设备。
四、粗纯
利用亲和层析法去除宿主细胞蛋白(HCPs)和培养基血清蛋白等杂质。其中HCP 构成了AAV生产工艺过程与过程相关杂质的主要组成部分。其残余HCP含量通常被认为是产品的关键质量属性，因为HCP有可能影响产品的安全性和功效，相关的风险主要是免疫原性。因此，监管机构的要求是在生物工艺开发过程中监测制品中残余HCP的去除情况。
与HCP相关的风险通常通过下游工艺能力、残留HCP水平、最大剂量、给药途径、给药频率、毒理学数据和临床数据相结合进行评估。可以通过开发强大的下游纯化生物工艺来作为风险控制策略，将HCP去除至尽可能低的水平，但残余HCP的可检测性还取决于检测方法的灵敏度。各家药企可通过开发新型纯化方法并使用多种技术来评估在生产过程中可能潜在的HCP来解决这一风险。
欧洲药品管理局（EMA）指南CPMP/BWP/382/97指出，“总之，对于HCP，无论产品和生产工艺如何，都必须定期测试残余HCP”，因此还需要定期对HCP进行例行检测。
五、中度纯化：层析进一步去除主要杂质。
六、精纯
通过层析去除微量杂质并拿到最终纯化产品。典型的层析方法包括亲和层析法和离子交换层析(IEC)，其中亲和层析的产量及纯度都较高，但它不能区分空壳病毒的和实心病毒。
此外，亲和层析法最大的挑战之一是由于该方法特异性较高，不同AAV血清型需要不同的层析填料，成本较高。值得关注的是，近期推出的一种新型填料-CaptoAVB可同时适用于多种不同AAV血清型，且该填料基于最新的基架技术，可承受更高的流速和更高的动态载量，PH适用范围更广，填料清洁再生后，可多次重复使用，降低了成本。
空壳AAV通常是由生产过程中的病毒包装不完全所产生。空衣壳由于完全缺乏基因组物质，或者只包含基因组的某些片段，但在纯化性质上与目标产物极其相似（空衣壳和完整病毒粒子的电荷和大小相似），因此被认为是最难以去除的杂质。
空衣壳对于最终产品的免疫原性具有潜在影响，将直接影响AAV载体产品的有效性和安全性。去除空衣壳杂质的两种常用方法包括氯化铯密度梯度离心法和阴离子交换色谱法(AEX）。
氯化铯密度梯度离心法是早期开发的一种纯化AAV的方法，等密度梯度离心的优势是可以从空颗粒中分离完整衣壳，缺点是不适合用于商业化的GMP生产，也不适合用于AAV规模化生产，另外为避免铯的重金属毒性，已开始替代使用碘克沙醇。
目前更多使用离子交换层析（IEC）来分离去除空壳AAV，在IEC中，空衣壳和完整病毒粒子衣壳在层析出的峰上有明显的重叠，这意味着要完全消除空衣壳AAV，就必须牺牲部分完整病毒粒子，进一步降低了AAV的产量。此外，使用的洗脱条件，如极端的pH和高电导率，这些条件会导致AAV衣壳受损，也对填料的要求更高，这也是一个亟需解决的问题。
质量可控的规模化的载体生产能力是AAV基因治疗行业发展的重要推动力，也是降低研发成本、获得价格优势的关键之一。在完成了以上6步，就需要进行罐装，同时在AAV进入临床运用前，还需要对载体进行非常严格的质量检测，如AAV空壳/实心比率，杂质含量等，从而使AAV载体在临床运用时将可能发生的意外风险降至最低。
在多种质量检测方法中，透射电子显微镜（TEM）是最直接的观测方法，也是常用的半定量测量方法。透射电子显微镜使用加速电子束穿过待检测样品，形成了纳米级别分辨率的图像。它通常使用负染色，通过重金属染色剂甲酸铀酰增加对比度，负染色后背景是暗的，所观察对象AAV载体是亮的，从而可以直观地反映AAV实心与空壳的比率。
为了分析空壳率，必须为每个AAV样品拍摄多张图像，每张图像的衣壳颗粒含量变化一般不超过2%，需要对数千个衣壳颗粒进行成像和分析，以确保统计学的显著性。
结语
基因疗法是获得业界关注的创新治疗平台。而作为递送转基因的有力手段，AAV载体的研发也在出现指数型增长，下篇我们将详细盘点一下CGT领域的CDMO企业各有哪些高端技术，请持续关注。
此外，AAV的发展仍然需要克服多项挑战，其中包括如何经济有效地生成足够数量的治疗性AAV载体，以及克服人体免疫系统对AAV载体和转基因产物的免疫排斥作用。克服这些挑战对推广AAV介导的基因疗法具有关键性的意义。
期待随着AAV研发领域的不断扩展和多学科手段的应用，我们能够克服目前遇到的挑战，实现AAV基因疗法的全部潜力。
1、Santiago-Ortiz JL, Schaffer DV. Adeno-associated virus (AAV) vectors in cancer gene therapy. J Control Release. 2016;240:287–301.
2、Srivastava,Arvind, et al. "Manufacturing challenges and rationalformulation development for AAV viral vectors." Journal ofPharmaceutical Sciences
3、公开网站
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