2022年9月13日/医麦客--星耀研究院新闻 PharmaBIGStar News/--mRNA产品开发的挑战之一就是它们的稳定性差。目前大多数mRNA疫苗是通过肌肉注射给药的，mRNA在注射部位被宿主细胞摄取，继而表达出抗原。mRNA疫苗的早期研究表明，裸露的mRNA在给药后会迅速降解。因此，人们一直在努力改善体内给药后mRNA的稳定性，主要是通过给mRNA包封的方法来减缓其降解。
包封的基础是递送系统的设计开发。良好设计的递送系统才能使mRNA分子进入人体后避免被RNA酶降解，继而被有效递送至靶点、穿过细胞膜并在胞内释放。LNP是目前最佳的递送系统，与其他递送系统相比，其包封效果、体内外表达效果、体内安全性等方面都更具优势。国内亦有多家相关企业投资研发核酸药物脂质纳米颗粒递送系统关键技术，例如：艾博生物，斯微生物，丽凡达生物等。
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包封过程大致可分为以下几个步骤：
1.将各种脂质成分按一定的比例进行混合，溶解在乙醇或其他有机溶剂中；
2.将mRNA溶解于水中，并用酸性缓冲液稀释至合适浓度。
3.将配置好的两相溶液在微流控设备上进行均匀混合，快速制备包裹mRNA的核酸脂质纳米颗粒。
其中，与微流控设备匹配的核心耗材为微流控芯片。
▲ 微流控芯片通道示意图
具体的操作过程，以目前主流的LNP为例，首先是要确认LNP的配方。Moderna公布的脂质成分包括可电离的阳离子磷脂、中性辅助磷脂、胆固醇、PEG修饰磷脂，它们的摩尔比为50:10:38.5:1.5。如下图所示，mRNA(红色)与离子化的带正电荷的脂质分子(黄色)亲水末端结合形成复合物，脂质的疏水端向外与辅助脂质(蓝色、绿色)疏水端结合，形成稳定的脂质双分子层结构。
▲ LNP的mRNA包封结构
接着就是工艺过程的控制，即如何控制mRNA与脂质成分的接触和相互作用过程，以形成稳定、均一、收率高的mRNA-LNP复合物。公开报道的LNP制备方法有超声波、剪切、均质(高压&微射流)、挤出等。
以当前主流的微流控混合技术来说，Pfizer/BioNTech采用的是冲击式射流混合器，mRNA溶于偏酸性水相，脂质体溶于乙醇，通过高压使mRNA溶液与脂质体溶液形成两股射流对冲混合，强烈的湍流使各组分充分混合，同时乙醇相被稀释，溶液pH变化，脂质体析出形成脂质纳米颗粒并与mRNA形成包封复合物。
mRNA包封涉及的工艺设备及耗材主要是微流控设备和流路耗材，现有厂家有PNI/Danaher, PreciGenome, Dolomite Microfluidics, 迈安纳, 艾特森等。原材料/试剂除mRNA原液外主要是各种脂质体成分，最关键、用量也最大的的是阳离子脂质，相关厂家有国外的Polymun, PNI/Danaher, Evonik, 以及国内的艾伟拓, 西宝生物, 白云山汉方等。
不同的厂家可能采用不同的微流控混合/挤出技术，尤其是微流道的设计，但通过两相混合形成包封复合物这一原理是一致的。影响最终产品质量的因素除了两相溶液自身成分特性、具体微流控混合/挤出技术外，还包括两相溶液的注入温度、压力、流量、比率等。
目前国内可提供mRNA包封服务的CDMO企业有荷塘生华、凯莱英、楷拓生物等。
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LNP-mRNA包封率检测
包封率(EE)是对 mRNA-LNPs 进行质量控制的关键指标，表示包裹在 LNP 内部的 mRNA 占全部 mRNA 的比例，通常要求包封率不低于 80%。通过对包封率的检测，不仅可以摸索LNP配方和包封参数，也能够监测LNP-RNA稳定性随时间发生的改变，还可以确定疫苗接种给药的剂量。目前检测包封率的方法主要有以下几种：
核酸探针RNA荧光法
对包封率的检测一般采用核酸探针RNA荧光法。分别检测破乳前(未包封游离mRNA)后(总mRNA)样品和标准品孔的荧光强度，以 mRNA浓度和荧光强度进行线性拟合，计算包封率(EE%)=(总 mRNA量-游离mRNA量)/总mRNA量×100。此外，还使用此荧光法进行mRNA-LNPs稳定性和可贮存性评价。
包封率测定
在进行加样时，可以选用试剂盒自带的标准品，同样也可以使用mRNA样品作为标准品开展实验。对IVT后纯化并修饰的mRNA样品进行浓度测定，梯度稀释样品mRNA可作为标准品，拟合标曲并用于包封率的测定。
数据处理：将测得的游离mRNA浓度和总mRNA浓度分别作为数据集，通过公式编辑器将包封率计算公式内置入检测方案模板进行计算可轻松获得包封率结果。将检测方案保存在软件数据库中可快速调取并开展多板检测。
稳定性
➤ 尽管目前在提高mRNA-LNP疫苗的体内稳定性和功效方面取得了进展，但对其储存过程中的稳定性仍然关注较少。目前公开资料中几乎没有关于mRNA-LNP制剂长期储存稳定性数据，因此尚不清楚在LNP中包封的mRNA会在多大程度上改善mRNA疫苗的长期储存稳定性。
关于LNP包封对mRNA的结构和形态、LNP组分的化学稳定性和mRNA-LNP系统的胶体稳定性也知之甚少。一方面主要原因在于目前上市的mRNA疫苗均针对新冠病毒加速审批，所以对于未来肿瘤mRNA疫苗，业内人士认为依然有必然进行长期的稳定性研究。
另外，LNPs与脂质体的不同之处在于微粒中存在脂质，来自几项研究的数据表明水也存在于微粒内部某些空间，这也意味着mRNA即使被包封也可能暴露于水性环境中。
➤ 除了mRNA的完整性外，LNP的稳定性对于mRNA-LNP疫苗的质量也至关重要。目前的mRNA疫苗没有披露关于LNP稳定性测试的数据。
Fan等人总结了脂质体和 LNP的稳定性及其质量属性。LNP可以承受化学和物理不稳定性，化学不稳定性包括 LNP 中易水解和氧化的脂质的降解。脂质氧化可能发生在不饱和脂肪酸部分(Comirnaty 和 mRNA-1273不存在该问题)和胆固醇，氧化可能是PEG2000 -DMG中PEG基团存在杂质导致的结果。除此之外，氧化性杂质也可能导致包封的mRNA氧化。脂质例如 DSPC和可电离的阳离子脂质中的羧酸酯键容易受温度和pH依赖性的水解的影响。
LNP稳定性的另一个关键因素是物理稳定性，主要有三种类型的物理不稳定性：包封的药物的聚集、融合和泄漏。LNP在储存和流通过程中容易发生 LNP的聚集，所以为了增加稳定性，LNP中通常添加PEG化脂质，LNP微粒表面的PEG分子可防止LNP聚集。另一种类型的物理不稳定性主要由于mRNA的泄漏。
尽管mRNA-LNP的共同特征是脂质，但确切结构特征及其对脂质成分(摩尔比)和mRNA定位的依赖性仍存在争议。目前可对LNP-mRNA的组成进行优化，如改变脂质比例或脂质-mRNA比例、创新隐形脂质、以及通过针对特定组织的定位和LNP-mRNA治疗药物对特定细胞类型和器官的主动靶向，改善当前的脱靶效应，并为难以靶向的组织的新应用铺平道路。
据《mRNA-LNP新冠疫苗的结构与稳定性》，mRNA疫苗所包封的mRNA会影响终LNP的结构：siRNA 在结构和分子量大小上与 mRNA有很大不同，并且N/P(可电离的阳离子脂质与核苷酸磷酸盐)摩尔比不同，mRNA至少比siRNA大100倍，这会影响LNP的结构。 此外，有迹象表明mRNA 可以在LNP的核形成“囊泡”。LNP囊泡部分的组成是一个有争议的问题，在这种状态时，mRNA可以从带电的脂质中解离，留在充满溶剂的“囊泡”隔室中。
另外，Arteta等人的实验发现他们的mRNA-LNP 外壳是单层的，而其他研究人员根据冷冻电镜或SANS结果分析提出，mRNA-LNPs 的外壳由一个或多个双层组成。这些相互矛盾的发现表明，使用这些技术评估mRNA-LNP壳的性质是存在困难的，可能存在多种类型的mRNA-LNP结构，其结构取决于脂质的性质和mRNA-LNP 的制备方法。反过来，不同的结构可能会对不同配方的稳定性产生影响。总之，问题仍然在于目前我们尚不清楚 mRNA-LNP 的结构以及包封的mRNA 与各种脂质成分之间的相互作用。
对各种mRNA疫苗成分的分析表明，它们具有共同特征，但也存在差异。LNP配方、修饰核苷的使用、高GC含量以及常规mRNA和SAM 疫苗(自扩增mRNA疫苗)之间的长度差异可能会影响这些mRNA疫苗在储存过程中的物理和化学稳定性。
由于注射 mRNA-LNP疫苗时的超敏反应可能与PEG化脂质有关，因此，已经研究了防止聚集体形成的替代脂质。使用多聚肌氨酸修饰脂质能使脂质递送系统更加稳定，在防止LNP聚集的同时能够减少超敏反应。但是目前仍然需要更多的实验来确定这种 PEG化脂质替代品是否能真正的提高 mRNA 的稳定性(例如不含过氧化物，注：目前使用的PEG脂质由于工艺原因，会有一定的过氧化物杂质，这会引起LNP中其他含有不饱和键的脂质和mRNA的氧化降解)。
着眼于国内，目前有三大难题依然制约国内脂质纳米颗粒技术的发展：1.辅料的缺乏，脂质纳米颗粒辅料的研发，辅料国产化；2. 缺乏成熟的工业化生产设备；3.缺乏既懂得制剂学和高分子材料学，又懂得制药工程设备的人才。
总的来说，mRNA-LNP疫苗的稳定性和长期保存是非常重要的，而其中关键点就是LNP内的mRNA链稳定性和LNP载体稳定性。有效的mRNA-LNP设计需要包含多种考虑和选择，并且需要根据治疗目的进行设计研究。作为mRNA技术的重要痛点之一，包封技术还亟需发展和完善。
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3、mRNA技术
12、mRNA全球肿瘤研发进展
13、mRNA新冠疫苗的商业化
14、mRNA政策法规全解读
16、mRNA 上游企业盘点
17、mRNA纯化法汇总
