进行Real Time PCR实验时，需要做哪些确认工作?
如何确认模板中是否含有阻害物质?
扩增曲线的荧光信号值低的原因是什么?
PCR扩增效率低的原因有哪些?
这几个问题，你们在实验中，自己已经有答案了吗？在今天，我们将会介绍PCR实验 中的一些常见的问题，我们一起往下看吧！
1PCR扩增效率低的原因有哪些?
问＆答-------------------------------------------
由标准曲线的斜率计算得到的PCR扩增效率低时，可以考虑以下几点原因。
1. PCR反应性能差。引物、试剂、PCR条件的再摸索。
2. PCR阻害物质的混入。模板提取方法的再摸索。
3. 标准品稀释不准确。使用专用标准品稀释Buffer。
稀释的低浓度标准品常常有易分解不稳定的现象产生，所以使用的稀释液中最好加入与实验材料不同生物种的tRNA和rRNA以起保护作用。但偶尔也有因加入的tRNA和rRNA的序列与目的基因序列具有同源性而产生的干扰现象。如果使用不含tRNA和rRNA的标准品稀释专用试剂EASY Dilution（for Real Time PCR）（Code No. 9160），将不会有这方面的顾虑。
2进行Real Time PCR实验时，需要做哪些确认工作?
问＆答-------------------------------------------
进行Real Time PCR首先要确认的工作如下：
1. 引物和探针的序列是否有错误?组合是否正确?
2. Total RNA是否有分解的可能?
3. 各种试剂是否忘记加入?
4. PCR条件和荧光检出步骤是否设定正确?
如果有成功反应经历的模板（Positive Control），设置Positive Control反应，很容易进行以上项目的确认。Total RNA一定要通过电泳和OD分析确认其质量。
3如何确认模板中是否含有阻害物质?
问＆答-------------------------------------------
有时Total RNA或cDNA中含有对反转录反应和PCR反应的阻害物质（如RNA提取时使用的有机溶剂等）。为了确认这样的阻害物质的有无，使用较高浓度的模板按3～4个梯度稀释，并使用其进行Real Time RT-PCR反应或Real Time PCR反应。如果无阻害物质存在，得到的Ct值会依存模板浓度的变化而变化；如果有阻害物质存在，就会发现高浓度的模板有反应性能下降的现象。
4扩增曲线的荧光信号值低的原因是什么?
问＆答-------------------------------------------
扩增曲线存在问题时，首先应确认基线校正或ROX校正前的原始曲线，扩增曲线的荧光信号值低多数是由于背景荧光信号值过高造成的。如下图所示，A的原始扩增曲线背景荧光信号值约为280，其基线校正后的扩增曲线显示较高的荧光信号值（约500）；而B的原始扩增曲线背景荧光信号值可达800，其基线校正后的扩增曲线荧光信号值较低（约150）。使用SYBR Green I嵌合荧光法进行检测时，背景荧光信号偏高大多数是由于模板量过高，SYBR Green I嵌入到初始模板DNA中发出荧光造成的。使用荧光探针法进行检测时，背景荧光信号偏高大多是由于设计的探针质量差使淬灭基团的淬灭作用不充分、报告基团和淬灭基团的搭配不合理、探针的荧光标记效率低等原因造成的。
背景荧光信号值确认图例
5出现扩增曲线朝右下方下落现象的原因是什么?
问＆答-------------------------------------------
出现这种现象一般有两种可能，如下图所示。
1. 由于基线校正不恰当。确认设置的基线校正范围的参数，按仪器说明书要求重新设定再进行解析。
2. 使用的模板量过多，扩增曲线过早起峰，使基线校正不能正常进行。当扩增曲线在10 Cycles以内起峰时，要将模板稀释100～1000倍后使用。
扩增曲线朝右下方下落的解决图例
6 PCR扩增效率过高的原因是什么?
问＆答-------------------------------------------
PCR扩增效率比理论值偏高，大多是由于反应体系中含有PCR阻害物质，需要改进模板提取方法。另外，使用SYBR Green I嵌合荧光法检测时，有时非特异性扩增也会导致PCR扩增效率高，要通过融解曲线分析加以确认。
7融解曲线分析有复数峰产生的原因有哪些?
问＆答-------------------------------------------
首先怀疑发生了目的片段以外的扩增。
1. 引物二聚体等非特异性扩增。优化PCR条件或再设计引物。
2. 存在目的基因的Variant。获取Variant信息，再设计引物。
3. Genomic DNA来源的扩增。DNase I处理或考虑基因组结构、引物再设计。但也有偶尔例外的情况。那是由于目的序列内部GC含量等的不均一造成同一扩增产物解离稍有偏差，致使虽然为特异性扩增，但融解曲线分析却出现非单一峰型的情况，但此时电泳确认结果却为单一条带（如下图所示）。因此，对初次使用引物的扩增产物有必要进行电泳确认，其目的有两个：①单一峰型时可以确认扩增片段大小，判断是否为目的产物；②非单一峰型时也有必要对扩增产物进行确认，如果电泳结果显示为单一条带，并与目的片段大小吻合，可以判断为进行了特异性扩增。
融解曲线分析特例
转自：细胞之邦
欢迎关注
杭州博日科技官方网站
www.bioer.com.cn
