阳离子交换层析(CEX)作为抗体下游纯化中常见的层析策略，用途极为广泛。其原理是，当蛋白所在缓冲液体系低于蛋白质等电点1-2 pH时，蛋白质带正电荷，会与填料上的负电荷基团结合，随后可通过改变pH或/和盐浓度来进行洗脱。
很多项目研究结果表明，该策略对高聚体和电荷异构体的去除具有比较好的效果，但由于某些特殊原因，洗脱时有时会出现劈峰现象，增加下游工艺开发难度与挑战。因此，缓解劈峰现象对保障下游工艺的顺利进行、提高整体纯化的效率具有重要的意义。
据报道，有些抗体表现出浓度依赖的可逆自我结合与解离。高浓度NaCl和高浓度蛋白会诱导形成与层析柱结合更紧密的自我结合片段，导致形成第二个大的洗脱峰。洗脱后，可能是由于流动相的稀释，可逆的自我结合片段解离成单体。由于填料上存在弱结合位点和强结合位点，因此形成了两个峰，分别具有快速和慢速结合动力学[1]。
组氨酸是蛋白质中出现频率偏低的氨基酸，但由于其咪唑基团接近中性，组氨酸参与许多生物学功能。随着溶液pH的变化，组氨酸可以质子化（带电）或非质子化（中性）。组氨酸残基的平均pKa值为6.0，但其实际的pKa取决于其周围环境。疏水环境中的组氨酸残基通常具有更偏酸性的pKa（下移），并且可能还具有较慢的质子化速率。因此有研究指出，CEX上出现洗脱双峰的现象怀疑是由于分子CDR区的组氨酸质子化引起。
如图1，高纯度的mAb A在阳离子层析填料POROS HS上进行盐梯度洗脱实验时，出现了双峰的现象。在对前峰与后峰分别取样进行二次CEX纯化后发现，两者的洗脱峰型相似，且仍存在双峰的现象。即使在不同的上样载量（1~20 g/L）条件下，双峰现象也并未消除。在进行等电聚焦、质谱、动态光散射、差示量热扫描等分析后，均未发现两峰产品间存在显著差异，且排除了抗体的可逆自我解离因素。因此推断组氨酸质子化引起了电荷异构体产生，组氨酸残基带电荷状态不同导致蛋白与填料的结合强弱不同，从而造成洗脱时出现双峰现象[2]。
图1. mAb A在POROS HS50上线性梯度洗脱的双峰表现。
（A）在pH 5.0的POROS HS50上，mAb A在20 CV线性洗脱梯度(0–500 mM NaCl)上的洗脱曲线。（B）从每个峰中分离蛋白质的二次纯化导致相似的双峰模式。（C）不同载量的洗脱曲线。
有研究结果表明，出现劈峰的产品一起收集后进行检测，产品质量没有问题，但在申报时会受到监管机构的挑战，因此在工艺开发时有必要单独收集劈峰产品，并进行产品质量检测。此外，应尽量避免此类现象的出现。
尽管造成劈峰的原因多种多样，可能和最开始分子的设计与构建、上游细胞培养等有关，进而使得蛋白质在填料上结合力不均一。但经越来越多的研究与尝试，目前下游纯化工作中也开发出多种解决方案。
不同的填料有不同的分辨率。有研究结果表明，通过对阳离子交换层析填料的筛选，可以为组氨酸质子化速度减慢导致的双峰模式提供相对快速的解决方案（如图2），但这种解决方案可能会导致目标产品回收率的损失。
图2. mAb A在不同阳离子交换层析填料上的洗脱曲线（黑色箭头代表肩峰）。
有研究报道[1]，在Capto SP ImpRes上进行多组实验，50 mM 精氨酸、组氨酸和赖氨酸作为缓冲液中的添加剂（保证缓冲液的pH恒定），NaCl作为洗脱盐。如图3所示，与不添加的实验相比，氨基酸的存在会导致蛋白质在较低的NaCl下被洗脱，同时也会降低第二个峰。其中，组氨酸的效果最明显。
图3. Capto SP ImpRes线性梯度洗脱中使用不同流动相改性剂的洗脱曲线。
凯莱英生物具有成熟、稳健的下游工艺开发平台，能实现高纯度、有针对性的下游纯化，同时在解决CEX劈峰现象上也有着丰富的经验累积。除了CEX填料筛选与额外添加氨基酸之外，还可以采用的解决方案有：
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通过优化洗脱方式，可采用步级洗脱或梯度洗脱的方式消除劈峰现象；
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通过CEX中不同缓冲液体系的筛选，也可达到缓解劈峰现象的效果；
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通过增强洗脱力（调整pH或/和盐浓度）来实现缓解劈峰现象（产品质量满足要求的前提下可采用该手段）；
以上解决方案均在凯莱英生物下游工艺开发中进行了充分的应用，同时实现了安全稳健的放大生产。
凯莱英生物赋能各类蛋白分子的工艺开发，致力于提供高效、优质的一站式CDMO服务。
[1] Haibin Luo, Nathaniel Macapagal, Kelcy Newell, Effects of salt-induced reversible self-association on the elutionbehavior of a monoclonal antibody in cation exchangechromatography. Journal of Chromatography A, 1362 (2014) 186–193
[2] Haibin Luo, Mingyan Cao, Kelcy Newell. Double-peak elution profile of a monoclonal antibody in cation exchange chromatography is caused by histidine-protonation-based charge variants. Journal of Chromatography A, 1424 (2015) 92–101.
