2023年合成生物学竞赛·创新赛第七期《常规赛科普专题》文章来自西北工业大学的NPU-MazeinYeast团队，题为“揭秘基因剪刀——CRISPR-Cas9/dCas9系统”。
揭秘基因剪刀——CRISPR-Cas9/dCas9系统
基因编辑技术
你知道什么是基因编辑吗？基因编辑就是利用一些特殊的工具，可以在细胞的基因上进行增删改，从而改变细胞的性质和功能。我们知道，世界上的所有生物，小到肉眼不能观察的细菌，大到重量可达数吨的鲸鱼，它们的外形和行为都会受到基因的影响。那什么是基因呢？简单地说，基因是一段能够发挥生物功能的DNA序列，在几乎所有的生物体内都有由四种脱氧核苷酸相互连接形成的链状分子，它们被我们称为DNA，而在这些DNA链上，有一些小片段具有指导、调控细胞合成蛋白质和其他生物分子的功能，它们包含着生物发育的全部信息，控制着生物的形态和行为，这些DNA片段就是基因[1]。DNA的序列不同，它所构成的基因就不同，基因所控制的生物形态或功能就不同。有另外一些生物分子可以和DNA发生作用，改变DNA的序列，从而改变基因，与之所对应的生物形态或生物功能就会随之发生改变。正是因为有这种奇特的反应，我们的科学家们才能发明多种基因编辑的方法，从而改造生物，为我们人类带来利益。
CRISPR/Cas9系统
如果你关注生物或化学领域，你一定记得2020年诺贝尔化学奖颁给了研究CRISPR/Cas9系统的两位科学家。这个系统是一种利用细菌的免疫系统来进行基因组编辑的技术，它可以非常精确的改变DNA的序列，从而简单高效地改造出我们需要的基因[2]。也正是因为这个特点，这个系统被广泛地应用到基因功能、治疗与基因突变有关的疾病研究、农作物种子培育等领域。
要理解这个系统的原理，还需要了解两种生物分子——蛋白质和RNA，其中蛋白质是生命活动的主要承担者，而RNA是在DNA和蛋白质之间传递信息的信使。CRISPR/Cas9系统中的Cas9指的就是一种可以识别目标序列并与DNA结合进行切割的蛋白质。CRISPR/Cas9系统要发挥作用需要经历两个过程。首先，我们需要人为设计一段具有引导作用的RNA，我们将其称为guide RNA即gRNA，恰如其名，它是一个称职的导游：gRNA有两个部分，一部分可以与Cas9蛋白结合，另一个部分可以和DNA结合[3]。当我们把 gRNA转入目标细胞中后，gRNA会先和Cas9蛋白结合，然后将其带到DNA的特定位置上。Cas9蛋白就会在DNA的对应位置发挥功能，同时切断DNA的两条链。细胞面对这样的“威胁”，有两种应对的方式，一种是非同源末端连接，这种方式极容易出现突变，修复后基因往往难以正常表达，这就实现了基因的敲除；另一种方式是同源重组，其必要条件是具有同源的DNA模板，这时只要我们人为提供这个模板，基因就会按我们想要的结果修复，实现基因的替换[5]。结合两种方式，CRISPR/Cas9系统就达到了我们编辑基因的目的。
图 1 CRISPR/Cas9 系统介导基因编辑示意图[4]
你或许会想，对基因的编辑难道只能是替换和敲除这两种方式吗？其实不然，细胞中存在一些生命活动所必需的基因，如果我们冒失地将其直接敲除，很可能会直接导致细胞的死亡[4]。针对这一类基因，科学家们对CRISPR/Cas9系统进行了改造，让其变得更加“温和”，这就是CRISPR/dCas9系统。显然，它最大的不同正是在Cas9蛋白上，dCas9蛋白中可以切割双链DNA的部分失活了，但是它仍然可以发挥作用[6]。比如它庞大的身躯可以占据启动子区域，妨碍RNA聚合酶的结合，从而降低目标基因的表达水平；或者它也可以和转录激活因子结合，促进目的基因的表达；又或者它和荧光蛋白结合，向我们标记出目的基因在细胞的空间位置以及动态[4]。
图 2 CRISPR/dCas9系统的三种功能
有了这两种系统作为基因编辑的工具，从完全敲除到过表达，我们终于可以实现精准调控基因的表达水平了。
CRISPR/Cas9和dCas9系统有很多优点。第一，这项技术非常简单，我们只需要设计合适的gRNA就可以实现对任意目标基因的编辑；第二，这项技术十分高效且灵活，gRNA和Cas9或dCas9蛋白的结合具有很高的亲和力和特异性，可以快速地找到并编辑目标基因，而且只要对gRNA和Cas9或dCas9蛋白稍加改造就能实现不同类型的基因组编辑；第三，这项技术可以同时靶向多个基因，实现多重编辑或全基因组筛选[7]。当然，这项技术也可能产生脱靶效应，即切割或调控非目标位点的DNA，导致意外的突变或损伤。总之，CRISPR/Cas9和dCas9系统的应用前景是非常广阔的，它们可以用于基因组编辑和调控，从而在研究基因功能、疾病机制、药物开发、基因治疗、作物改良、微生物改造等领域发挥重要作用[4]。
[1] CRICK, F. Central Dogma of Molecular Biology. Nature 227, 561–563 (1970). DOI:https://doi.org/10.1038/227561a0.
[2] 谷思宇,杨晓梅,贺俊崎.CRISPR/Cas9基因编辑技术:基因剪刀—重写生命密码的工具——2020年诺贝尔化学奖简介[J].首都医科大学学报,2020,41(06):1014-1018.
[3] Martin Jinek et al. ,A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity.Science337,816-821(2012).DOI:10.1126/science.1225829.
[4] 郑武,谷峰.CRISPR/Cas9的应用及脱靶效应研究进展[J].遗传,2015,37(10):1003-1010.DOI:10.16288/j.yczz.15-070.
[5] 刘博雅,杨鑫,任梦梦等.DNA损伤修复机制——解读2015年诺贝尔化学奖[J].中国生物化学与分子生物学报,2015,31(12):1322-1329.DOI:10.13865/j.cnki.cjbmb.2015.12.15.
[6] 刘思远,易国强,唐中林等.基于CRISPR/Cas9系统在全基因组范围内筛选功能基因及调控元件研究进展[J].遗传,2020,42(05):435-443.DOI:10.16288/j.yczz.19-390.
[7] 吴言,郝雅荞,韦璇等.新一代精准基因编辑工具CRISPR/Cas9的技术优势与应用局限[J].生物技术通报,2018,34(05):1-8.DOI:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-1100.
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