“Nature communications∣人工设计磷酸依赖型酶级联反应，实现甲酸到甲醛的高效转化”
文献信息：
Maren Nattermann, Sebastian Wenk, Pascal Pfister, Hai He, Seung Hwan Lee, Witold Szymanski, Nils Guntermann, Fayin Zhu, Lennart Nickel, Charlotte Wallner, Jan Zarzycki, Nicole Paczia, Nina Gaißert, Giancarlo Franciò, Walter Leitner, Ramon Gonzalez, and Tobias J. Erb.
https://doi.org/10.1038/s41467-023-38072-w
Nature communications 影响因子：17.694
背景介绍
通过（电）化学手段固碳生产的甲酸，可通过体外酶级联催化或工程微生物转化为增值产品，可被视为碳中和生物经济的核心。扩大合成甲酸同化的关键步骤是甲酸还原生成甲醛的过程，这个过程在热力学上具有挑战性。
在这里，作者开发了一个新型的磷酸盐（Pi）依赖的双酶途径，甲酸首先被活化为甲基磷酸，随后被还原生成甲醛。利用乙酸激酶和N-乙酰-γ-谷氨酰磷酸还原酶的多功能性，作者分别在体外和体内验证和展示了这个以磷酸盐为基础的途径。随后，作者通过进一步改造获得甲基磷酸还原酶变体以提高微生物体内甲基磷酸的转化，并将其与Pi途径耦合，实现了大肠杆菌高效利用甲酸生成C2化合物。
图文解读
图1 对可还原甲酸生成甲醛的不同途径进行设计和分析
a不同途径的反应示意图。
对于每个途径，使用以下颜色编码提供了各自的酶：T4F途径（紫色），CoA途径（浅蓝色），Pi途径（深蓝色）。可以用于在CoA和Pi途径之间切换的PTA显示为灰色。
*表示（可能的）新型反应。ACS 乙酰辅酶A合成酶，ACR 酰辅酶A还原酶，PTA 磷酸乙酰转移酶，ACK 乙酸激酶，FPR 甲基磷酸酯还原酶，FTL 甲酸四氢叶酸连接酶，MTC 亚甲基四氢叶酸环化醇酶，MTD 亚甲基四氢叶酸脱氢酶，T4F 四氢叶酸，spon. 自发水解。
b 使用NADPH（实线）或NADH（虚线）作为还原当量，对三种途径进行的MDF计算。
各个反应的能量轮廓见《补充表1》。
c在大肠杆菌中通过三种途径和RuMP途径生产12种相关代谢前体以及生物量的FBA计算。
g6p 葡萄糖-6-磷酸，f6p 果糖-6-磷酸，e4p 4-醣醛磷酸，r5p 核糖-5-磷酸，g3p 甘油醛-3-磷酸，3pg 甘油酸-3-磷酸，pep 磷酸烯醇丙酮，pyr 丙酮酸，accoa 乙酰辅酶A，akg 2-酮戊二酸，succoa 丁酰辅酶A，oaa 草酰乙酸。
表1 乙酸激酶对甲酸的动力学参数
显示了对技术上的三重复（n = 3）进行的Michaelis-Menten拟合的结果，同时提供了标准差。曲线详见附图1。
图2 在多样化的代谢酶中发现多能性甲酰磷酸还原酶活性
a 多种大肠杆菌酶对甲酰磷酸还原活性的比较。通过EcAckA（来自50 mM NH4甲酸盐）原位产生甲酰磷酸。
通过Nash测定法检测甲醛，显示了各自的测量结果和均值的线性回归。数据点表示独立的技术复制品（n = 3）。数据相对于没有甲酸盐的对照进行了基线校正。
b 关于对甲酰磷酸的活性的ArgC同源物的比较。
实验如a所述进行，显示了各自的测量结果和均值的线性回归。数据点表示独立的技术复制品（n = 3）。负对照见《补充图3》。
cArgC同源物的系统发育。显示了具有<60%同源性的同源物的50倍bootstrap邻接进化树，已选择的同源物在树上标出。
d在50 mM NH4甲酸盐存在或不存在的情况下，EcAckA + DaArgC在E. coli BL21 (DE3) ΔfrmRAB中产生的甲醛。
显示了各自的测量结果和均值的线性回归。数据点表示独立的生物学复制品（n = 3）。甲醛的检测如（a）所述。
e EcAckA和DaArgC在E. coli BL21 (DE3) ΔfrmRAB中的表达的SDS-PAGE。该凝胶为独立的生物学复制品产生相同结果的代表性图像（n = 3）。
EcAckA 大肠杆菌乙酸激酶，AtArgC 拟南芥N-乙酰-γ-谷氨酰磷酸脱氢酶，BcArgC 克劳氏芽孢杆菌N-乙酰-γ-谷氨酰磷酸脱氢酶，CsArgC 热泉纤维杆菌N-乙酰-γ-谷氨酰磷酸脱氢酶，DaArgC 去硝乙酸杆菌N-乙酰-γ-谷氨酰磷酸脱氢酶，EcArgC 大肠杆菌N-乙酰-γ-谷氨酰磷酸脱氢酶，PtArgC 台湾假单胞菌N-乙酰-γ-谷氨酰磷酸脱氢酶。
表2 DaArgC变体的动力学参数
Michaelis-Menten拟合和独立技术重复的标准差（n = 3）。
a与EcAckA结合的测量。
b观察到的最大活性，[甲酰磷酸] = 46 mM。
c 活性低于检测限。
图3 DaArgC的酶工程
aDaArgC的活性位点和底物结合域的卡通描绘（PBD-ID 8AFU，分辨率2.0 Å）。NADPH（灰色）的建模基于MtArgC的结构（PBD-ID 2I3G）。负责结合天然底物的磷酸盐和羰基的HRH基序以及形成共价中间体的半胱氨酸在浅灰色中标出。适应天然底物支链的残基在黑色中标出。
b 文库筛选方法的示意图。
c DaArgC的迭代饱和和随机突变。通过饱和突变（第1-4轮）或随机突变（RDM）生成DaArgC变体，并在BL21 DE3 ΔfrmRAB中产生。如图左上角所示，将甲酸添加到培养物的上清液中。孵育后，取样并通过Nash测定法检测甲醛以评估相对性能。显示出增加活性的突变体作为下一轮的亲本。
符号表示各自的测量结果。EcAckA 大肠杆菌乙酸激酶，DaArgC 去硝乙酸杆菌N-乙酰-γ-谷氨酰磷酸脱氢酶，MtArgC 结核分枝杆菌N-乙酰-γ-谷氨酰磷酸脱氢酶。
图4 DaArgC变体的验证
aDaArgC的晶体结构（PBD-ID 8AFU，2.0 Å）和b DaArgC3（PBD-ID 8AFV，2.2 Å）。NADPH（灰色）的建模基于结核分枝杆菌ArgC的结构（PBD-ID 2I3G）。受突变影响的活性位点残基显示为棒状。
cDaArgC变体的体内产物性能。在大肠杆菌BL21 DE3 ΔfrmRAB ΔpflAB中产生EcAckA和DaArgC变体，并向上清液中添加甲酸。通过四个时间点的线性回归评估甲醛产生速率。显示均值与标准偏差以及各个数据点。数据点代表独立的生物复制品（n = 3）。
d EcAckA + DaArgC变体的体外甲醛产生。数据的评估方法与c相同。显示均值与SD以及各个数据点。数据点代表独立的技术复制品（n = 3）。
EcAckA 大肠杆菌乙酸激酶，DaArgC 去硝乙酸杆菌N-乙酰-γ-谷氨酰磷酸脱氢酶。c和d的线图显示在《补充图9》中。
图5 Pi途径可以整合到FORCE途径中，从甲酸产生C2化合物
a 生产甲醛和甲酰-CoA以供给FORCE途径下游反应所需的甲酸活化/还原反应方案。
b Pi和CoA模块在体外产生乙二醇基-CoA。显示了单次测量、技术复制品的均值和标准误差（n = 3）。
c经3小时的休克培养后，Pi和CoA模块在活细胞中产生的乙二醇。显示了单次测量、生物复制品的均值和标准误差（n = 4）。
BsACS 枯草杆菌乙酸激酶，EcAckA 大肠杆菌乙酸激酶，DaArgC 去硝乙酸杆菌N-乙酰-γ-谷氨酰磷酸脱氢酶，LmACR 李斯特菌酰基-CoA还原酶，GCS 乙二醇基-CoA合成酶，EcAldA 大肠杆菌乙二醇醛脱氢酶。
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