“Nature Communications∣最小化表型扰动的工程菌株理性设计”
文献信息：
作者：Bharath Narayanan, Daniel Weilandt, Maria Masid, Ljubisa Miskovic, Vassily Hatzimanikatis
接收时间：24 January 2024
https://doi.org/10.1038/s41467-024-44831-0
Nature Communications 影响因子：17.694
背景介绍
在生物技术领域，设计遗传干预以精准塑造细胞表型是一项充满挑战的任务，它不仅耗费时间，也消耗大量资源。随着基因编辑技术的进步和组学数据的日益丰富，代谢研究迎来了前所未有的发展机遇。然而，尽管科技进步为遗传操作提供了便利，确定操作目标及其程度仍是一大难题。设计的菌株需要对环境变化具有鲁棒性，这就要求遗传干预不能破坏细胞的关键属性，如能量电荷和氧化还原电位。通常需要针对多个酶开发策略来实现这一点。但直接通过实验来设计这样的多目标策略，不仅耗时而且成本高昂。
为了降低这些成本，研究者们开始利用计算模型进行合理代谢工程，以缩小需要实验验证的策略范围。动态代谢模型尤其适合这项工作，因为它们能够捕捉代谢状态对环境和遗传扰动的时间演变，尤其是在现实发酵条件下。但是，由于缺乏关于动力学参数值的信息，这些模型的发展受到了阻碍。
本文中，作者介绍的NOMAD（非线性动态模型辅助的合理代谢工程设计）框架，为解决这一难题提供了新思路。NOMAD利用混合整数线性规划和非线性模拟，与大规模非线性动力学模型相结合，来设计遗传干预，同时考虑到这些扰动的网络效应。它不仅保证了工程菌株的鲁棒性，而且通过保持其表型与参考菌株相近，确保了其生理特性的稳定性。
以提高大肠杆菌中邻苯二甲酸盐产量为例，NOMAD框架设计了包括八个先前经过实验验证目标的实验实施方案。我们期待，NOMAD框架将在未来的设计-构建-测试-学习（DBTL）周期中扮演关键角色，显著加速菌株设计的进程，与传统的全面设计枚举相比，这一框架有望大幅提升效率，为生物技术和生物医学领域带来革命性的变革。
图文解读
图1 | NOMAD概述及每个步骤所需的工具
我们首先整合不同类型的数据来构建一组假定的动力学模型，由一组常微分方程(ODEs)表示。接下来，我们根据动态特性选择模型，例如它们的稳定性、重现实验发酵数据的能力，以及对酶干预的鲁棒性。最后，我们使用选定的模型进行菌株设计。这包括解决一个混合整数线性规划(MILP)优化问题，枚举保持工程菌株接近参考菌株的设计，评估这些设计的性能，并为实验实施对它们进行排名。
图2 | 模型筛选过程的结果
a 我们从800,000个假定的动力学模型中筛选出10个具有所需线性化动态特性、能重现实验观察到的发酵曲线，并且对酶扰动证明是鲁棒的模型。
b-d 模拟的10个模型与实验批量发酵数据相比的生长(b)、邻苯二甲酸盐(c)和葡萄糖(d)的响应。橙色实线和阴影区域分别代表模拟响应的中位数和四分位数范围。实心圆圈和误差条代表三次实验的均值和标准偏差。
在批量发酵条件下，10个动力学模型的行为与实验数据非常接近。
源数据作为源数据文件提供。
在不同允许的与参考菌株(wt)相比浓度的倍数变化下，工程菌株的邻苯二甲酸盐(a)和生物质(b)的平均响应。当我们允许从参考生理状态偏离更大，从2倍(实线蓝色)到20倍(点线蓝色)浓度变化时，我们观察到在参考菌株的发酵期末(18小时)K_trpD9923的邻苯二甲酸盐和生物质滴度普遍下降。此外，完全无约束的菌株设计方法仅使用前三控制系数(MCA)会抑制生长以及邻苯二甲酸盐的产生。这些结果强调了在进行菌株设计时坚持参考生理状态的重要性。源数据作为源数据文件提供。
每个设计包含一组要被靶向的独特酶。
SHKK 为磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸激酶，CHORS 为磷酸赤藓醇胺合成酶，DHQS 为3-脱氢奎尼酸合成酶，CHORM 为磷酸赤藓醇胺变位酶，ANS 为邻苯二甲酸盐合成酶，ANPRT 为邻苯二甲酸盐磷酸核糖基转移酶，DDPA 为3-脱氧-D-阿拉伯庚糖酸7-磷酸合成酶，GND 为磷酸葡萄糖酸脱氢酶，PFK_3 为磷酸果糖激酶(s7p)，RPI 为核糖-5-磷酸异构酶，G6PDH2r 为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，NADH5 为NADH脱氢酶，SUCDi 为琥珀酸脱氢酶（不可逆），HEX1 为己糖激酶，PGK 为磷酸甘油酸激酶，PYK 为丙酮酸激酶，PGM 为磷酸甘油酸变位酶，PGI 为葡萄糖-6-磷酸异构酶，PPS 为磷酸烯醇式丙酮酸合成酶，GAPD 为甘油醛-3-磷酸脱氢酶，FBA 为果糖双磷酸醛缩酶，PFK 为磷酸果糖激酶，TPI 为三磷酸甘油醛异构酶，FBP 为果糖双磷酸酯酶，ENO 为烯醇酶，PSERT 为磷酸丝氨酸转氨酶，GLUDy 为谷氨酸脱氢酶，GLNS 为谷氨酰胺合成酶，ACONTa 为顺乌头酸酶，AKGDH 为2-酮戊二酸脱氢酶，ICDHyr 为异柠檬酸脱氢酶，FUM 为延胡索酸变位酶，ICL 为异柠檬酸裂解酶，ME2 为苹果酸酶(NADP)。源数据作为源数据文件提供。
图5 | K_trpD9923模型
实施重组菌株修改后的性能
a W3110 trpD9923(wt, 橙色)、
b 三种菌株的实验记录数据。实心圆圈和误差条代表三次实验的均值和标准差。模型捕捉到实验观察到的趋势，与单独靶向aroG相比，tktA的过表达产生了更优的邻苯二甲酸盐滴度。与实验设计的仿真实施相比，NOMAD设计提供了更优的邻苯二甲酸盐滴度。面板中展示的体外菌株胞外葡萄糖和生物质的时间演变见补充说明4。源数据作为源数据文件提供。
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