“NAT COMMUN∣结合发酵代谢与呼吸模块，设计好氧发酵工程菌底盘”
文献信息：
作者：Helena Schulz-Mirbach, Jan Lukas Krüsemann, Theofania Andreadaki, Jana Natalie Nerlich, Eleni Mavrothalassiti, Simon Boecker, Philipp Schneider, Moritz Weresow, Omar Abdelwahab, Nicole Paczia, Beau Dronsella, Tobias J. Erb, Arren Bar-Even, Steffen Klamt, Steffen N. Lindner
接收时间：28 July 2024
https://doi.org/10.1038/s41467-024-51029-x
Nature Communications 影响因子：16.6
背景介绍
在生物工业领域，微生物厌氧发酵可高通量生产多种生物基产品而备受青睐。然而，这一技术背后，隐藏着一个精细调控的挑战：维持微生物内部的氧化还原平衡。一旦这种平衡被打破，不仅原料的适用范围受限，产品的多样性和产量也会受到影响。
为了打破这一局限，这篇文章开拓了一种创新途径：通过结合发酵与呼吸模块，设计出一种新型的代谢途径。这一路径借助氧气的力量，对原本不平衡的发酵过程进行再平衡，实现更精确的代谢调控。
通过基因工程手段改造了大肠杆菌，使其能够在有氧条件下，高效地将葡萄糖转化为乳酸。随后，通过巧妙地整合辅酶依赖的甘油-3-磷酸脱氢酶，研究者不仅实现了甘油到乳酸的高效转化，还展示了如何将多余的电子有选择性地转移到呼吸链上。
最为引人注目的是，这项技术的应用不限于此。研究者还成功地将甘油发酵过程中的代谢流向异丁醇生产方向引导，这不仅拓宽了微生物发酵的应用范围，更为生物制造领域带来了新的可能。
图文解读
图 1 | 呼吸和发酵过程中的细胞电子流
A 电子传递链的示意图表示。电子（蓝色箭头）从还原当量转移到 NADH 脱氢酶（蓝色，Ndh 和 Nuo）和辅酶脱氢酶（橙色，NAD(P)H 依赖的或其他的，例如琥珀酸脱氢酶）。辅酶充当电子的中间载体，直到氧气作为最终电子受体被末端氧化酶（绿色）接受。Nuo 和末端氧化酶产生质子（H+）梯度，为 ATP 合酶（紫色）提供动力。这种转移允许辅酶从辅酶还原为辅酶醇；通过呼吸链的转移由蓝色箭头指示。
缩写：H+, Q/QH2—辅酶/辅酶醇。
B 均质乳酸发酵的化学计量学。左侧：葡萄糖的平衡发酵；中间：甘油的不平衡发酵；右侧：通过辅酶依赖的甘油-3-磷酸脱氢酶（由 glpD 编码）重新平衡的甘油控制呼吸-发酵。
通过这种设计，我们重定向了甘油的发酵通量，使其朝向异丁醇的生产。
图 2 | 强制发酵 NNmini 菌株的遗传干预和概念
A 删除了已知和推测的依赖辅酶的反应。上面的虚线框表示编码已知（Nuo & Ndh）和推测的 NAD(P)H 脱氢酶和 NAD(P)H:辅酶氧化还原酶的基因。在 nuo 操纵子（nuoABCDEFGHIJKLMN）的情况下，删除 nuoEFG 就足够了，因为编码的亚基对电子传递至关重要，因此对 Nuo 功能至关重要。请注意，在 iML1515 模型中，Nuo 催化的反应由于与质子梯度的生成相关，与 Ndh 表示为不同的反应。下面的虚线框：辅酶依赖的脱氢酶可以与直接的 NAD(P)H 依赖对应物形成 mini-循环，已被删除以防止从还原当量到辅酶的持续电子传递。
B 野生型（左侧）和好氧发酵 NNmini 菌株（右侧）细胞呼吸期间电子通量（蓝色箭头）的示意图。由于所有允许从还原当量到辅酶的电子传递的反应都被破坏（由红色十字表示），菌株依赖于发酵产物的分泌来维持氧化还原平衡。
A. NNmini 菌株（右）和野生型菌株（左）在不同葡萄糖浓度下的生长情况。
B. NNmini 菌株生长到远低于野生型的生物量产量，通过 OD600 值表示。显示的是重复测量的平均值。
C. 在最小培养基中不同葡萄糖浓度下好氧培养的 NNmini 菌株培养上清液中检测到的乳酸浓度（产量为每摩尔葡萄糖产生 1.78 ± 0.2 摩尔乳酸）。对于野生型，未检测到乳酸，因此不能以对数尺度表示。显示的是重复测量的结果。来源数据提供为一个源数据文件。
A. 在补充乙酸的情况下，预期的碳流向 NNmini 菌株生长在葡萄糖上的选定生物量前体的示意图。由于苹果酸脱氢酶（Mqo）和琥珀酸脱氢酶（Sdh）的缺失，乙酸只能用于从较低的代谢过程中产生生物量前体。因此，预计在橙色着色的代谢物中可以找到来自乙酸的碳。其中，亮氨酸（部分由丙酮酸和乙酰-CoA 合成）、脯氨酸和精氨酸（均源自α-酮戊二酸）预计会携带来自乙酸的碳，与上部代谢的氨基酸不同。紫色插图：参与将丙酮酸转化为乙酰-CoA 的酶的示意图。Pfl 对氧气敏感，因此只能在厌氧条件下运作。Pdh 产生 NADH 并受其抑制。
B. NNmini 菌株在 10 mM 葡萄糖与不同乙酸浓度下的生长情况。使用 20 mM 苹果酸（非发酵性）+ 10 mM 乙酸作为阴性对照培养基，以证明乙酸本身不允许 NNmini 菌株生长。
C. 不同乙酸、丙酮酸或胱氨酸氨基酸（CAA）浓度的喂养对生长改善的比较。显示的是重复测量的平均值，浓度以 g/L 给出，以便与没有明确分子量的复杂培养基 CAAs 进行比较。
D. 在 20 mM 葡萄糖 + 10 mM 13C2-乙酸条件下培养的 NNmini 菌株中，发现的丙氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、脯氨酸和精氨酸的同位素标记模式。
只有源自乙酰-CoA 的亮氨酸和源自α-酮戊二酸的脯氨酸和精氨酸是双标记的。
缩写：α-KG α-酮戊二酸，3-PG 3-磷酸甘油酸，Pfl 丙酮酸甲酸裂解酶，Pdh 丙酮酸脱氢酶。来源数据提供为一个源数据文件。
图 5 | NNmini + glpD 菌株的有氧甘油发酵
A. NNmini + glpD 菌株中甘油代谢的示意图表示。glpD 的重新引入允许将一对电子转移到辅酶，这重新平衡了甘油发酵成乳酸。
B. 在含有不同甘油浓度（右侧指示）的最小培养基上，工程化 NNmini 和 NNmini + glpD 菌株的生长情况。
C. 与以甘油为唯一碳源的野生型相比，NNmini + glpD 菌株的生物量产量（以最大 OD600 值表示）较低（n = 1）。
D. 在不同甘油浓度下培养的 NNmini + glpD 菌株的上清液中检测到的乳酸（产量为每摩尔甘油产生 0.85 ± 0.14 摩尔乳酸）。显示的是重复测量的结果。来源数据提供为一个源数据文件。
A. 甘油发酵为异丁醇的示意图表示。通过删除天然的乳酸合成途径（ΔldhA），代谢通量可以被重新定向到异丁醇。异丁醇合成的基因表达来自 pIBA 质粒（优化的 pIBA4）。异丁醇途径方案改编自 Ghosh 等人。
B. 以甘油为唯一碳源的 NNmini ΔldhA +glpD+ pIBA 菌株在有无 IPTG 的情况下的生长情况。在这里，乙酸除了“无 IPTG”条件外，还作为阴性对照。
C. 在不同甘油浓度下培养的 NNmini ΔldhA + glpD + pIBA 菌株的上清液中检测到的发酵产物。显示的是三次重复测量的平均值和标准偏差。来源数据提供为一个源数据文件。
表 1 | 本研究中使用的菌株和质粒
表 2 | IDMS 测量目标的参数设置
表 3 | LCMS 测量目标的参数设置
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