Nat. Catal∣首次设计固氮酶组装途径，使大肠杆菌固定氮气合成氨
文献信息：
作者：Joseph B. Solomon, Chi Chung Lee, Yiling A. Liu, Calder Duffin, Markus W. Ribbe, Yilin Hu
接收时间：19 August 2024
https://doi.org/10.1038/s41929-024-01229-x
nature catalysis 影响因子：42.8
背景介绍
在应对全球农业、能源和环境挑战的进程中，生物技术正开辟新的道路。其中，固氮酶的异源表达因其在这些领域的应用潜力而备受瞩目。固氮酶是一种能够将大气中的氮气转化为氨的生物催化剂，对自然界的固氮循环起着核心作用。尽管科研工作者一直致力于将固氮酶的功能引入非固氮微生物，但此前尚未成功从这些宿主中分离出具有活性的固氮酶。
最近，科研领域迎来了一项重要进展。研究团队通过将Azotobacter vinelandii和Methanosarcina acetivorans的基因在大肠杆菌中进行重组，成功实现了活性钼固氮酶的异源合成。这一成果不仅通过金属分析、活性测试和电子顺磁共振(EPR)谱等方法证实了固氮酶中金属中心的完整结构，而且还通过生长实验、纳米级二次离子质谱(nanoSIMS)和核磁共振(NMR)实验展示了大肠杆菌能够利用合成的固氮酶进行固氮作用，且在敲除特定基因后，能够在细胞外积累氨。
这项研究的重要性在于，它不仅证实了在非固氮宿主中合成复杂金属酶的可行性，而且为未来通过转基因技术提高固氮酶的表达和应用奠定了基础。进一步优化这一系统，有望为提高氮素利用效率、减少化肥依赖，并推动可持续农业和生物制造领域的创新发展。
图文解读
图1 | 一种自下而上的金属中心方法来异源表达固氮酶
Mo-固氮酶的生物合成包括两个组分：
1) P-簇的原位组装，涉及将一个[Fe4S4]簇对融合到NifDK上的P-簇([Fe8S7])，导致含有P-簇但缺乏M-簇的NifDKapo（红色箭头）；以及
2) M-簇的非原位组装，涉及将一个[Fe4S4]簇对耦合/重排到NifB上的L-簇([Fe8S9C)，同时插入一个间隙碳和一个第九个硫，通过NifH介导的Mo/顺乌头酸（hc）插入，将L-簇成熟为M-簇([(R-homocitrate)MoFe7S9C])在NifEN上，并通过NifDKapo传递M-簇，导致含有P-和M-簇的NifDKholo（蓝色箭头）。我们最近在大肠杆菌中异源表达和生化/光谱表征含有P-簇的NifDKapo（绿色）、含有L-簇的NifB（黄色）和含有[Fe4S4]簇的NifH（深蓝色）的成功，实施了生物合成途径的关键检查点（由√表示），以验证固氮酶复杂金属中心的异源合成。在这些结果的基础上，可以实施含有M-簇的NifEN（深棕色）作为异源表达完整Mo-固氮酶之前的最后一步检查点。这种金属中心的、分而治之的方法允许在任何外来宿主中自下而上地构建固氮酶的生物合成途径，并强调了通过分析纯化固氮酶组分的金属簇含量和功能能力来证明固氮酶异源表达的必要性。
图2 | AvNifDKEc的生化和光谱分析
a, 纯化的AvNifDKEc的SDS-PAGE。显示的是三个独立实验的代表性图像，结果可重复。在大肠杆菌菌株YM577EE中异源表达（见补充表2），AvNifDKEc是由大约50 kDa和49 kDa的α-和β-亚基组成的异源四聚体。标准品，Precision Plus Protein Kaleidoscope预染蛋白标准品（Bio-Rad）。
b, IDS氧化的AvNifEN和AvNifDKEc的垂直模式EPR光谱。还显示了AvNifDKEc在g = 1.94处的L-簇特异性EPR信号，其信号强度基于L-簇含量进行了归一化（红色虚线）。
c, AvNifEN和AvNifDKEc的Fe分析。通过从每个NifEN四聚体的总Fe原子数中减去两个永久[Fe4S4]簇中的八个Fe原子，计算AvNifEN或AvNifDKEc的L-簇含量。以百分比表示的AvNifDKEc相对于AvNifEN的相对L-簇含量（设为100%）用红色字体表示。
d, AvNifEN和AvNifDKEc在催化（Catal.）和M-簇组装（Assem.）中的活性分析。以百分比表示的AvNifDKEc相对于AvNifEN的相对活性（设为100%）用红色字体表示。有关Fe含量和特定活性的详细信息，见补充表3。误差条代表平均值的标准偏差，来源于AvNifDKEc和AvNifEN的三次独立Fe分析（c）和三次独立活性分析（d）的结果。
a, 纯化的AvNifDKEc的SDS-PAGE。显示的是三个独立实验的代表性图像，结果可重复。在大肠杆菌菌株YM587EE中异源表达（见补充表2），AvNifDKEc由两个约30 kDa的亚基组成的同源二聚体。标准品，Precision Plus Protein Kaleidoscope预染蛋白标准品（Bio-Rad）。
b,c, 氧化（Ox）、还原（Red）和超还原（SR）状态的AvNifDKEc（红色）与天然AvNifH对应物（黑色）的垂直（b）和平行（c）模式EPR光谱。AvNifDKEc或AvNifH的三种氧化状态是通过用IDS（Ox）、二硫苏糖醇（Red）和EuII-EGTA（SR）处理蛋白产生的。在AvNifH和AvNifDKEc的还原光谱中观察到的S = 3/2信号也以5倍增强的强度显示。
d, AvNifH和AvNifDKEc的Fe分析。以百分比表示的AvNifDKEc相对于AvNifH的相对Fe含量（设为100%）用红色字体表示。
e, AvNifH和AvNifDKEc在催化（Catal.）和M-簇组装（Assem.）中的活性分析。以百分比表示的AvNifDKEc相对于AvNifH的相对活性（设为100%）用红色字体表示。有关Fe含量和特定活性的详细信息，见补充表4。误差条代表平均值的标准偏差，来源于AvNifDKEc和AvNifH的四次独立Fe分析（d）和四次独立M-簇组装活性分析（e），以及AvNifDKEc和AvNifH的四次和六次独立催化活性分析（e）。
a, 纯化的AvNifDKEc的SDS-PAGE。显示的是三个独立实验的代表性图像，结果可重复。在大肠杆菌菌株YM538EE中异源表达（见补充表2），AvNifDKEc是由α-和β-亚基组成的异源四聚体，分别约为56 kDa和59 kDa。标准品，Precision Plus Protein Kaleidoscope预染蛋白标准品（Bio-Rad）。
b, 二硫苏糖醇还原的AvNifDK、AvNifDKEc和AvNifDKEc-P*的垂直模式EPR光谱。AvNifDKEc显示出与AvNifDK相同的M-簇特异性S = 3/2信号（g = 4.31, 3.67, 2.01），其信号强度为后者的34%（设为100%）。此外，AvNifDKEc还显示出与P*-簇（即P-簇前体）特异性S = 1/2信号，与P*-含有但缺乏M-簇的AvNifDKEc-P*显示的信号无法区分。
c, IDS氧化的AvNifDK和AvNifDKEc的平行模式EPR光谱。AvNifDKEc显示出与AvNifDK相同的P-簇（POX）特异性信号（g = 11.8），其信号强度为后者的58%（设为100%）。
d, AvNifH和AvNifDKEc的活性分析。以百分比表示的AvNifDKEc相对于AvNifDK的相对活性（设为100%）用红色字体表示。+M-簇，用提取的M-簇重组的AvNifDKEc。有关特定活性的详细信息，见补充表5。误差条代表平均值的标准偏差，来源于AvNifDKEc和AvNifDK的三次独立活性分析，除了AvNifDK的C2H2还原活性分析来源于六次独立活性分析（d）。
图5 | AvNifDKEc中金属中心的分析分析
a, AvNifDK和AvNifDKEc的Mo和Fe分析。P-簇含量是通过从每个NifDK四聚体的总Fe原子数中减去与M-簇相关的Fe原子数（每个Mo七个Fe）来计算的。注意，AvNifDKEc的P-簇位点（标记为Fe（P-site））包含来自P-和P*-簇的Fe原子。以百分比表示的AvNifDKEc相对于AvNifDK的相对Mo和Fe含量（设为100%）用红色字体表示。有关Fe和Mo含量的详细信息，见补充表5。误差条代表平均值的标准偏差，来源于AvNifDKEc和AvNifDK的三次独立Fe分析和三次独立Mo分析（a）。
b,c, 均质柠檬酸标准品和从AvNifDK和AvNifDKEc提取的M-簇中均质柠檬酸组分的气相色谱（GC）（b）和气相色谱-质谱（GC-MS）（c）。用于识别该有机化合物的衍生化均质柠檬酸片段的m/z比值在GC-MS碎片模式（c）中指出。
a, 在含有限量氨（2 mM）的培养基中，大肠杆菌菌株YM538EE在100% N2（实心圆圈）或Ar（空心圆圈）下的厌氧细胞生长。在接种后5小时（红色箭头），当细胞生长达到最大细胞密度的约50%时，诱导表达固氮酶，并允许细胞生长继续至接种后12小时（蓝色箭头）。误差条代表标准误差，来源于六个独立的细胞生长实验。
b, YM538EE的固氮对细胞生长的贡献，显示在诱导后7小时细胞密度增加了26.2% ± 5.1%。在IPTG诱导开始（接种后5小时）或结束（接种后12小时）时，固氮贡献（以百分比表示）通过将N2下的细胞密度（a, 实心圆圈，在5或12小时）与Ar下的细胞密度（a, 空心圆圈，在5或12小时）之间的差异除以Ar下的细胞密度（a, 空心圆圈，在5或12小时）来计算。误差条代表平均值的标准偏差，来源于六个独立的实验。
图7 | 表达固氮酶的大肠杆菌菌株的固氮氮同化作用
a, 来自纳米二次离子质谱（nanoSIMS）实验（b-e）的二次离子图像的统计分析：
（1）在100% 15N2存在下表达固氮酶的大肠杆菌菌株YM538EE（b）；
（2）在100% Ar存在下表达固氮酶的大肠杆菌菌株YM538EE（c）；
（3）在100% 15N2存在下生长的大肠杆菌菌株MY21（d）；
以及（4）在100% 15N2存在下生长的A. vinelandii菌株DJ1141（e）。
A. vinelandii菌株DJ1141在含有限量氨的培养基中好氧生长，然后在氨耗尽后3小时进行去抑制或上调固氮酶表达。
每个样品或对照（a）的15N丰度是基于相应nanoSIMS图像（b-e）中的六个不同感兴趣区域（ROIs）收集的数据计算的。
15N丰度（或15N/14N）的平均值，以六个不同ROIs的平均值的标准偏差表示，如下：（1）3.1% ± 0.1%，（2）0.38% ± 0.01%，（3）0.41% ± 0.01%和（4）25.4% ± 1.2%。
考虑到自然15N丰度，或15N/14N为0.37%（a中蓝线所示），每个样品的15N富集水平可以计算如下：（1）8.4倍，（2）1.03倍，（3）1.11倍和（4）69倍。
对于（1），15N富集也可以表示为3%的原子百分比富集和5.7%的净固定（Fxnet）（参考文献51）；此外，仅基于细胞密度增加了26%（图6b），可以计算出11.8% ± 0.4%的标准化15N丰度。15N2源的质量检查见补充图3。nanoSIMS实验在表达固氮酶的大肠杆菌菌株YM538EE的七个独立样品和在100% 15N2下生长的大肠杆菌菌株MY21的四个独立对照上进行。本图显示了样品和对照的代表性结果，六个额外样品和三个额外对照的统计分析见补充图4。
a, 在100% 15N2存在下表达固氮酶的大肠杆菌菌株YM559EE分泌的15NH4+的频率选择性脉冲1H NMR光谱，与图6a中描述的大肠杆菌菌株YM538EE相同。见补充表2以了解菌株构建。分泌的氨以每个细胞克数约2.5mmol NH4+量化。符号*表示14NH4+特有的三重信号。
b, 来自nanoSIMS实验（c,d）的二次离子图像的统计分析，其中大肠杆菌菌株MY21在(1) 15N2（c）和(2) 14N2（d）存在下用大肠杆菌菌株YM559EE分泌的NH4+培养。nanoSIMS实验（c,d）每个都在一个样品上进行。每个样品（b）的15N丰度是基于相应nanoSIMS图像（c,d）中的六个不同感兴趣区域（ROIs）收集的数据计算的。15N丰度（或15N/14N）的平均值，以六个不同ROIs的平均值的标准偏差表示，如下：(1) 1.6% ± 0.3%和(2) 0.42% ± 0.02%。考虑到自然15N丰度，或15N/14N为0.37%（b中蓝线所示），每个样品的15N富集水平可以计算如下：(1) 4.3倍和(2) 1.14倍。
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