“NAT CHEM BIOL∣用于靶向糖基化的固定化酶级联催化过程”
文献信息：
Elli Makrydaki, Roberto Donini, Anja Krueger, Kate Royle, Ignacio Moya Ramirez, Douglas A. Kuntz, David R. Rose, Stuart M. Haslam, Karen M. Polizzi, and Cleo Kontoravdi.
https://doi.org/10.1038/s41589-023-01539-4
nature chemical biology 影响因子：14.55
背景介绍
糖基化是一种关键的蛋白质后转录修饰，影响蛋白质的折叠、半衰期和功能。由于参与的酶的混合性，糖基化是一种非模板化和异质化的过程。
作者描述了一种用于定制糖结构的顺序糖基化反应平台（SUGAR-TARGET），该平台允许体外进行定制的、受控的N-链接糖基化，通过一步固定化/纯化方法产生固定化酶。作者重构了一个模拟糖基化途径的反应级联，其中自然存在酶的混合性，以人性化一系列来源于不同细胞系统的蛋白质，产生几乎均匀的糖基形式。固定化β-1,4-半乳糖转移酶用于增强三种IgG的半乳糖化剖面，产生80.2–96.3%的末端半乳糖化。对于大于80小时的反应时间，演示了酶的回收利用。
该平台易于实施、模块化和可重复使用，因此可以从各种宿主中产生派生的均一糖基结构，用于功能和临床评估。
图文解读
图1 | 用于靶向糖基化的人工高尔基反应（SUGAR-TARGET）的策略和设计
a，由GnTI、ManII、GalT和SiaT调控的N-链接糖基化途径。GalT同时识别GnTI和ManII的产物，使其成为一种高度杂交酶。
b，使用固定酶进行顺序糖基化反应。简便的酶回收以及空间和时间上的分离将产生所需的产物S1GalGM3，处于均匀状态。
c，体内生物素化策略。将目标酶的催化结构域与MBP融合在N末端，并与AviTag融合在C末端。为了确保功能性，在AviTag之前插入了一个小的两残基甘氨酸-丝氨酸（GS）连接器。生物素连接酶BirA识别AviTag并能进行酶促生物素化。
d，生物素化酶随后固定在涂有链霉亲和素的固体支持物上。
图2 | 实验过程，用于体内生物素化和一步固定/纯化GnTI和GalT
a，细胞收集后，通过超声波裂解细胞，将可溶性成分，包括酶，通过离心和脱盐分离。脱盐溶液与链霉亲和素颗粒混合以捕获生物素化酶。最后的离心步骤允许回收固定的酶，而未结合的物质则被丢弃。
b，使用凝胶移动法确认GnTI的生物素化。每条带有和不带有BirA和链霉亲和素的蛋白质在没有还原剂（DTT）的情况下加载。MBP–GnTI–AviTag的分子量为93.8 kDa，MBP–GalT–AviTAg的分子量为76.4 kDa。
c，使用凝胶移动法确认GalT的生物素化。每条带有和不带有BirA和链霉亲和素的蛋白质在没有还原剂的情况下加载。
d，一步固定/纯化后GnTI的回收。BirA非特异性结合。
e，GalT一步固定/纯化后的回收。
f，一步固定/纯化后SiaT的回收（分子量为76.8 kDa）；StV，链霉亲和素。
图3 | mFc上的固定酶级联
a，用GalT处理期间形成的双天冠结构。
b，CHO h-IgG在用固定化的GalT处理前后的糖型分布。
c，r-IgG在用固定化的GalT处理前后的糖型分布。
d，h-IgG在用固定化的GalT处理前后的糖型分布。
e，GalT处理IgG的分析（n = 2个生物学重复）。糖型使用乳糖基化指数进行比较，这是乳糖分子的测量结果，以最大乳糖分子数进行了归一化处理。
图4 | IgG与固定化GalT的处理
a，在GalT处理期间形成的双天冠结构。
b，CHO h-IgG在处理前后的糖基形式分布。
c，r-IgG在处理前后的糖基形式分布。
d，h-IgG在处理前后的糖基形式分布。
e，IgG与GalT处理的分析（n = 2生物学重复）。通过乳糖化指数比较糖基形式，乳糖化指数是对于最大乳糖分子数进行归一化的乳糖分子的测量。
图5 | 固定化GalT与糖基的反应
a，起始底物G0的电泳图谱。
b，与固定化GalT处理15分钟后，G0的反应产物的电泳图谱。
c，起始底物G0F的电泳图谱。
d，与固定化GalT处理15分钟后，G0F的反应产物的电泳图谱。
图6 | 固定化GalT的可重复使用性
a，CHO h-IgG在多个循环中的酶的可重复使用性和糖基分布。随着每个循环，半乳糖化的变化呈线性下降趋势（G0F的Pearson相关系数=0.94；所示结果来自独立实验，n=2个生物学重复）。
b，未经处理的IgG和第四次重复使用后处理的IgG的分析。糖基通过半乳糖化指数进行比较，该指数是将半乳糖分子归一化为最大半乳糖分子数（此处=2）。
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