理性设计导电纳米菌毛，阐明结构-电子传输功能关系
文献信息：
作者：Ben Myers, Francesco Catrambone, Stephanie Allen, Phil J. Hill, Katalin Kovacs, Frankie J. Rawson
发表时间：Published: 31 May 2023
https://doi.org/10.1038/s41598-023-35553-2
Scientific Reports 影响因子：3.8
背景介绍
细菌菌毛纳米线是一种特殊的蛋白质复合体，被认为具有电活性能力，并在细胞的生物能量代谢中发挥重要作用。这些纳米线的主要功能是促进细胞与外部环境之间的电子转移，从而支持细胞的代谢过程和细胞间的通信。然而，关于这些纳米线的具体结构和功能，尤其是位于IV型菌毛基础的纳米线与聚合细胞色素基础的丝状物之间的蛋白质成分，目前仍存在诸多争议和不同的假设。尽管已有研究对这些结构进行了探讨，但在完整细菌中的结构-功能关系分析仍然十分有限。
在最近的一项研究中，研究人员以模式自养生物Cupriavidus necator H16为研究对象，通过对其IV型菌毛蛋白进行不同芳香族修饰，成功建立了结构与功能之间的关系，并进一步探讨了这种关系对菌毛导电性及其结构的影响。研究采用了高分辨率的PeakForce隧道原子力显微镜（PeakForce TUNA™）技术结合传统电化学方法，首次实现了从完整细菌细胞中对导电纳米线的清晰解析。这一成果不仅标志着首次在有氧条件下利用Cupriavidus necator底盘成功生产出功能性IV型菌毛蛋白纳米线，而且为深入理解细胞与外部环境之间的生物电通信机制奠定了重要基础，具有广泛的研究和应用前景。
图文解读
图1. 设计、表达和验证 Cupriavidus necator H16 中修饰的 PilA (mpilA) 单体序列
(A–D) 原生 PilA 单体序列比对：
(A) Cupriavidus necator H16 (CN)；
(B) 铜绿假单胞菌 (PA)；以及导电单体：
(C) 地杆菌 sulfurreducens (GS) 和 (D) 地杆菌 metallidurans (GM)。
(E–H) 本研究中产生的修饰 CN PilA 序列：
(E)CN: T80，和 (F) CN: T61，具有结构修饰但无芳香族修饰的 PilA 单体。
(G)CN: T61Y，和 (H)CN: T61W 单体序列，同时具有结构修饰和增加的芳香族氨基酸含量。
序列 A 和 B (CN, PA) 为清晰起见限制在 100 个字符以内（分别来自 147 和 143）。方框残基表示同源区域，彩色残基表示芳香族性。比对通过 Bio Edit 产生。
(I) GS WT、CN WT、CN: T61（移除 C 末端 β-折叠但缺乏芳香族修饰）和 CN: T61W（T61 的改编，将天然氨基酸替换为色氨酸位于 32、51、57 位）的 IV 型 PilA 单体结构预测模型。芳香族残基被突出显示为红色（色氨酸）、蓝色（酪氨酸）或绿色（苯丙氨酸）分支，黑箭头指示氨基酸突变的位置。模型通过 Chimera 产生。
(J) pMTL70641:ΔpilA 敲除载体；
(K) 模块化 pMTL71301:mpilA 表达载体，mpilA 表达操纵子显示为 4.5 KB 处的黑箭头。质粒图通过 ChemBioDraw 产生。
(L) mpilA 表达操纵子的扩展图，每个变体的可变 mpilA 插入基因（绿色）位于 CN 的 PilA 识别序列之后，并与 C 末端 6xHIS 融合框内。对于非表达的阴性对照菌株，该区域被省略。
(M) 剪切菌毛提取物的 SDS-PAGE–Western 印迹，显示 WT 或 ΔpilA 菌株中不存在的约 9 kDa 处的 HIS 标签蛋白，用于 mpilA 变体。泳道标记所用菌株，以及用于验证免疫检测成功的 HIS 标签阳性对照 (HIS+)。
图2. 表达野生型（WT; ΔpilA）和修饰型（T80; T61; T61Y; T61W）IV型菌毛丝的C. necator H16菌株的PeakForce TUNA AFM
（A）峰值力误差和接触电流数据图像，每张图像左侧标注对应的菌株。Z尺度显示在WT图像的左下角，所有图像统一尺度为+150 mV至−150 mV（峰值力误差）和+1 pA至−1 pA（接触电流）。每张图像右下角的白条代表1 µm的横向尺度。
图表（B）和（C）显示接触电流（B）和高度（C）的线剖面梯度分析。
（B）接触电流峰值大小，对应于基线上pA的增加或减少。
（C）菌毛丝横截面高度。所有变体的平均丝形态为4.5–5.7 nm，WT和工程菌毛高度之间的差异不显著（p>0.05）。对于每个数据通道，每个变体共进行了九次测量，具体为三个丝上的三个剖面（n=9，N=3）。每个丝的平均值显示在补充信息图1和2中。线剖面分析通过Gwyddion进行。统计分析通过Graphpad Prism对实验样本与WT进行单因素方差分析（p<0.05）。显著差异比较用*表示，ns表示p>0.05的比较。
图3. 涂覆有mpilA细菌生物膜的丝网印刷碳电极的典型循环伏安图
各图左上角标注菌株。黑线为仅裸露培养基（pH 6.9的PBS+2%葡萄糖酸钠），橙线为细胞上清液，蓝线为细菌生物膜修饰电极。所有扫描先以100 mV/s进行50次扫描以在1 mV/s下使电极表面平衡，随后以1 mV/s进行两次扫描，显示第二次扫描结果。所有扫描在分别制备的样品上进行三次重复（n=3），平均峰值大小和位置显示在补充信息表3中。
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