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JACS∣机械响应性蛋白质晶体循环再生NADH，用于多循环酶反应催化

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2024-12-24

导读：NAD(H)依赖性酶在制药和精细化工产品的生物合成中扮演着关键角色，但其辅因子NAD(H)的有限循环利用能力限制了其在工业上的广泛应用。

文献信息：

作者：Reza Yekta, Xu Xiong, Jiaxin Li, Bradley S. Heater, Marianne M. Lee, and Michael K. Chan

接收时间：April 6, 2024

https://doi.org/10.1021/jacs.4c04725

JACS 影响因子：14.4

背景介绍

NAD(H)依赖性酶在制药和精细化工产品的生物合成中扮演着关键角色，但其辅因子NAD(H)的有限循环利用能力限制了其在工业上的广泛应用。

最近的研究进展中，科学家们开发了一种新型的机械响应性PEI（聚乙烯亚胺）修饰的Cry3Aa蛋白晶体，这种晶体能够在多个反应循环中实现NADH的有效循环再生。为了验证其实际应用潜力，研究者们还制备了一种含有共固定甲酸脱氢酶和亮氨酸脱氢酶的Cry3Aa蛋白颗粒，前者负责NADH的再生，后者则催化NADH依赖的L-叔亮氨酸（L-tert-Leu）的生物合成。

将这种蛋白颗粒与PEI修饰的Cry3Aa晶体结合使用时，构建的反应系统能够高效地进行L-tert-Leu的生物合成，且这一过程可以持续21天之久，NADH的周转数得到了显著提升，达到了原来的10.5倍。这一成果为提高NAD(H)依赖性酶的循环利用效率和降低生产成本提供了新的思路。

图文解读

图1|PEI-3A晶体的特性

图1展示了PEI-3A晶体的纳米通道结构以及通过扫描电子显微镜（SEM）和动态光散射（DLS）技术对其形态和尺寸的分析。图中可见，PEI修饰并未改变Cry3Aa晶体的棒状形态，但晶体的平均水动力直径略有增加，这可能是由于PEI分子与晶体表面的共价结合。此外，PEI修饰显著提高了晶体的正电荷，这有助于增强NADH的结合能力。

(a) Cry3Aa晶体中的纳米通道（PDB代码：1DLC）以带状显示，Asp和Glu残基以红色突出显示，并用CPK表示其分布。

(b, c) Cry3Aa和(d, e) PEI-3A晶体的SEM成像，分别为低倍（5000×）和高倍（150,000×）放大。

(f) Cry3Aa晶体在PEI介导的阳离子化前后的尺寸分布和(g) Zeta电位，使用Malvern Zetasizer Nano测量。

图2|体外培养的PEI-3A晶体，在有无NADH存在下的共聚焦图像

图像显示，结合的NADH在DAPI通道中呈现蓝色荧光，分布于整个PEI-3A晶体中。NADH的蓝色荧光遍布整个PEI-3A晶体，表明NADH在晶体内部有良好的分布和结合

图3|轨道振荡对PEI-3A晶体中NADH结合和释放的影响

本图说明了PEI-3A晶体对NADH的结合和释放是机械力响应（0~2000转/min）的，这一特性对于在多个酶反应循环中回收NADH至关重要。在2000转/分钟的条件下，超过83%的NADH可以从晶体中释放，而在停止摇动后，95%的NADH可以重新结合回晶体。

a) 通过增加机械振荡可以从PEI-3A晶体中大量释放NADH分子。

b) PEI-3A晶体中NADH的机械振荡诱导释放（红色圆圈）和重新结合（蓝色方块）可以重复多个循环。

图4|Cry3Aa-FDH/Cry3Aa-LDH颗粒和PEI-3A晶体在L-tert-Leu生物合成中的应用

这张图展示了结合使用Cry3Aa-FDH/Cry3Aa-LDH颗粒和PEI-3A晶体在生物合成L-tert-Leu中的协同作用优势。图中显示了在多个催化循环中，这种组合系统能够高效地进行L-tert-Leu的合成，并且与仅使用游离NADH的对照组相比，NADH的周转数显著提高。突出了NADH循环再生对提高反应效率和可持续性的重要性。

a) TMP和氨转化为_L-tert-Leu的酶促反应。

b) Cry3Aa-FDH/Cry3Aa-LDH颗粒 + PEI-3A-NADH晶体（实心条）和Cry3Aa-FDH/Cry3Aa-LDH颗粒 + 每个循环0.5 mM NADH对照组（图案条）在_L-tert-Leu生产中的多次催化循环。