NAT CHEM BIOL∣按需使用正交氧化还原辅因子，改变氧化还原反应平衡
文献信息：
作者：Derek Aspacio, Yulai Zhang, Youtian Cui, Emma Luu, Edward King, William B. Black, Sean Perea, Qiang Zhu, Yongxian Wu, Ray Luo, Justin B. Siegel, Han Li
接收时间：20 October 2023
https://doi.org/10.1038/s41467-021-24312-4
nature chemical biology 影响因子：12.9
背景介绍
自然界中，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）作为两种关键的氧化还原辅因子，各自维持不同的还原电位，分别推动分解代谢和合成代谢过程朝相反方向进行。这种区分确保了生物体内代谢过程的精确调控。然而，在生物制造领域，为了实现对氧化还原反应方向的灵活控制，需要一种能够独立于分解代谢和合成代谢的控制机制。
近期研究中，科学家们提出了烟酰胺单核苷酸（NMN+）作为一种新型的非典型辅因子，它与NAD(P)+的代谢途径正交，为生物制造提供了新的调控手段。研究团队开发了一种名为Nox Ortho的酶，这是一种专门针对NMNH（NMN+的还原形式）的氧化酶。结合NMN+特异性的葡萄糖脱氢酶（GDH Ortho），研究者们构建了一套能够调节NMNH与NMN+比例的工具，从而精细控制氧化还原反应的平衡。
通过对Nox Ortho的工程改造和模型构建，研究人员发现了一种设计原则，该原则能够被广泛应用于六种不同的酶，实现了从NAD(P)+到NMN+辅因子特异性的显著转变，转变幅度达到了103至106倍。这一发现不仅增强了NMN(H)作为辅因子的特异性，还为生物催化剂的设计提供了新的思路。
进一步的研究中，科学家们将这些经过改造的酶组装起来，在无细胞系统和大肠杆菌中成功生产出了立体纯的2,3-丁二醇。这一成果展示了NMN(H)在氧化还原比例上的独有特性，其由特定的驱动力设定，与NAD(H)和NADP(H)的代谢途径完全解耦，为生物制造提供了新的氧化还原平衡控制策略。
图文解读
图1|四个提出的BDO立体升级系统概述，用于测试两个正交辅因子之间的串扰
本图展示了四种提出的BDO立体升级系统，旨在测试两个正交辅因子之间的交叉使用。这些系统利用NAD(H)或NADP(H)作为氧化驱动力，而NMN(H)作为还原驱动力，以实现从meso-BDO到(SS)-BDO或(RR)-BDO的转换。图中清晰地展示了氧化和还原步骤，以及它们如何依赖于不同的辅因子。
b) m-BDO立体升级为(RR)-BDO，其中NMN(H)驱动氧化步骤，NAD(H) (b)驱动还原步骤。
c) m-BDO立体升级为(SS)-BDO，其中NADP(H)驱动氧化步骤，NMN(H)驱动还原步骤。
d)m-BDO立体升级为(RR)-BDO，其中NMN(H)驱动氧化步骤，NADP(H)驱动还原步骤。
e) 图解显示，当氧化和还原步骤之间发生串扰时，反应是可逆的且不完全的。上述四个系统不能使用单一辅因子或多个串扰辅因子实现。红色和蓝色分别表示氧化和还原。双色辅因子池框表示串扰和完全可逆的反应步骤。
f) 用于不同酶类中Bdhs的典型立体特异性和手性底物偏好。
g) Bdhs的单辅因子反应，没有辅因子回收反应驱动每个步骤。
h) 单辅因子反应，与L. brevis Nox WT一起回收NADH至NAD+驱动氧化步骤。
i) 单辅因子反应，与B. subtilis GDH WT一起回收NAD+至NADH驱动还原步骤。反应不会超过第一个氧化步骤。所有实验的底物为5 g/L m-BDO，转化率在30°C下48小时后测量。
图2|Ll Nox定向进化以排除NADH
图2展示了通过高通量基于生长的选择平台对Ll Nox进行定向进化的过程，以增强其对NMNH的活性并减少对NADH的活性。通过这一过程，研究人员能够识别出具有改进催化效率的变体，这些变体在NMNH氧化中表现出更高的活性，同时对NADH的活性显著降低。
b) Ll Nox WT（灰色）和Nox Ortho（黄色）对NADH、NADPH和NMNH的表观催化效率。在37°C下，50 mM Tris-Cl pH 7.0中进行测定，改变还原辅因子的浓度。
c) Nox Ortho与NMNH和FAD结合的姿态模型揭示了新的氢键形成。
d) Ll Nox WT（灰色）和Nox Ortho（黄色）与NADH结合揭示了NADH结合姿态的构象变化。Nox Ortho上的取代排除了NADH从其天然结合模式中脱离，使其暴露于溶剂中，与观察到的NADH催化效率降低一致。数据以三个独立重复的平均值呈现（n = 3），误差条表示一个标准差。白色菱形代表单个重复的值。进行了未配对样本的双尾t检验，假设方差不等（**P < 0.01**）：Ll Nox WT与Ll Nox Ortho（NADH, P = 0.00073; NMNH, P = 0.0017）。
图3|工程化Bdhs使用NMN(H)
图3展示了通过工程化改造，使Bdh酶能够特异性地使用NMN(H)作为辅因子。这些改造包括关键氨基酸残基的替换，这些替换增强了与NMN+的结合，并阻止了NAD(P)+的进入。结果表明，改造后的Bdh酶在NMN+的催化效率上有显著提高，而在NAD+和NADP+上的活性大幅下降，证明了设计原则的普适性和有效性。
b) Kp m-Bdh WT（灰色）和Kp m-Bdh Ortho（绿色）与每个辅因子的表观催化效率。底物为50 mM m-BDO，辅因子浓度不同。
c) 基于Kp m-Bdh Ortho（Kp m-Bdh位点）的类似替换转移，六个Bdh同源物的特异性活性。在(R/S)-Ac饲喂实验中测量的立体底物和产物偏好的总结（补充图6）。NT，未测试。底物为10 mM (R/S)-Ac，0.2 mM还原辅因子。一个酶活性单位被定义为每分钟消耗1 µmol还原辅因子（NADH、NADPH或NMNH）所需的酶量。
d) Ser (S)-Bdh Ortho与NMN+预测的相互作用。
e) Ser (S)-Bdh WT（灰色）和Ser (S)-Bdh Ortho（紫色）与每个辅因子的表观催化效率。Ser (S)-Bdh测定的底物为50 mM (SS)-BDO，辅因子浓度不同。条形图是三个独立重复的平均值（n = 3），除Ser (S)-Bdh WT与NAD+外，所有样本的误差条表示一个标准差（n = 4）。单独的重复以白色菱形显示。所有Bdhs的活性测定均在30°C下，50 mM Tris-Cl pH 8.0中进行。进行了未配对样本的双尾t检验，假设方差不等（*P < 0.05）：WT与Ortho催化效率（Kp m-Bdh：NAD+，P = 0.014；NADP+，P = 0.0014；NMN+，P = 0.0037；Ser (S)-Bdh：NAD+，P = 0.0012；NADP+，P = 0.0033；NMN+，P = 2.0 × 10-7）；NMNH特异性活性与NADH特异性活性（P = 0.0012, 0.00049, 0.00010, 0.035, 0.015和0.00079）；NMNH特异性活性与NADPH特异性活性（P = 0.00096, 0.00013, 4.4 × 10^-6, 0.037, 0.014和0.0041）。
图4|正交氧化还原驱动力在四个无细胞系统中实现BDO立体升级
图4展示了在无细胞系统中，利用正交氧化还原辅因子实现BDO立体升级的四个系统。这些系统展示了NMN(H)与NAD(H)或NADP(H)的正交性，以及它们在氧化或还原方向上提供独立驱动力的能力。图中的数据证明了这些系统能够高效地将meso-BDO转化为高纯度的(SS)-BDO或(RR)-BDO，突出了正交辅因子在生物制造中的潜力。
d-f) m-BDO至(RR)-BDO，搭配NMN(H)驱动的氧化步骤和NAD(H)驱动的还原步骤。
g-i)m-BDO至(SS)-BDO，搭配NADP(H)驱动的氧化步骤和NMN(H)驱动的还原步骤。
j-l) m-BDO至(RR)-BDO，搭配NMN(H)驱动的氧化步骤和NADP(H)驱动的还原步骤。
a,d,g,j, 反应路径图。
b,e,h,k, BDO和Ac异构体的浓度。分别在24小时、72小时、72小时和72小时取样进行气相色谱（GC）分析。
条形图代表三个或四个独立重复的平均浓度，误差条表示一个标准差。单独的重复以白色菱形显示。
c,f,i,l, 每种氧化还原辅因子的还原和氧化形态的浓度比率，以对数10为尺度。分别在48小时、72小时、48小时和24小时取样进行氧化还原比率测量。
GC和氧化还原比率分析的样品取自相同的反应。
条形图代表三个或四个独立重复的比率平均值，误差条通过氧化和总辅因子浓度测量的标准差传播计算得出。白色菱形代表单独计算的重复值。Ortho代表辅因子工程变体。Gluc, 葡萄糖酸。
对数变换的氧化还原比率进行了配对样本的双尾t检验，假设方差不等（**P < 0.01**）：NMN(H)与NAD(H)比率产生(SS)-BDO（P = 0.00027）和(RR)-BDO（P = 0.00024）；NMN(H)与NADP(H)比率产生(SS)-BDO（P = 0.000023）和(RR)-BDO（P = 0.000055）。
图5|在大肠杆菌中将m-BDO立体升级为(SS)-BDO的休眠细胞反应
图5展示了在大肠杆菌全细胞中，通过NAD(H)或NADP(H)与NMN(H)的正交组合，实现m-BDO到(SS)-BDO的立体升级。这些结果表明，通过补充NMN+，可以显著提高产物的纯度和转化率，进一步证实了NMN(H)在全细胞生物转化中的应用潜力。
b-d, 使用NAD(H)驱动的氧化步骤与NMN(H)驱动的还原步骤搭配的m-BDO至(SS)-BDO系统体内反应。
b, NAD(H)驱动的氧化步骤的反应途径细节。
c, 在培养基中补充0 mM或10 mM NMN+后，BDO和Ac立体异构体的浓度，30°C下24小时后取样。
d, 在不同NMN+补充条件下(SS)-BDO的产品纯度。
e-g, 使用NADP(H)驱动的氧化步骤与NMN(H)驱动的还原步骤搭配的m-BDO至(SS)-BDO系统体内反应。
e, NADP(H)驱动的氧化步骤的反应途径细节。
f, 在培养基中补充0 mM或10 mM NMN+后，BDO和Ac立体异构体的浓度，18°C下152小时后取样。
g, 在不同NMN+补充处理中(SS)-BDO的产品纯度。
条形图代表三个生物学重复的平均值，误差条表示一个标准差。白色菱形代表单个重复的值。对配对样本进行了双尾t检验，假设方差不等（P < 0.05）：0 mM与10 mM NMN+对(SS)-BDO和(S)-Ac百分比纯度的影响：c,d, P = 0.0015, 0.00047和0.0014；f,g,P = 0.0078, 0.016和0.0082。
产品纯度计算为(SS)-BDO在总产物形成量中的百分比（(R)-Ac, (S)-Ac, (RR)-BDO, (SS)-BDO和m-BDO）。
6-P-Gluc, 6-磷酸葡萄糖酸；Glucose-6P, 葡萄糖-6-磷酸；NaMN, 烟酸单核苷酸。
图6|可视化非典型氧化还原辅因子特异性酶设计的新兴设计原则
a,b) Nox（a）和Bdh（b）之前实验解析的结构的比对，这些结构与本研究中工程化的Ll Nox和Kp Dar相似（PDB 5VN0和1GEG）。绿色球体表示在Nox Ortho和Bdh Ortho中替换以阻止二核苷酸辅因子的类似位点。红色和蓝色球体标记提议形成NMN(H)极性相互作用的替换位点。Bdh的旋转视图显示了所有三个突变位点。
c) 从b中获得的Bdh的相同视图与其CATH超家族的617个成员叠加。深色区域是由于多个重叠结构造成的，并被解释为结构上保守的骨架位置的度量。
d) Bdh Ortho中存在的替换的放大图像。α2螺旋被突出显示为一个有前途的设计区域，并且大致与Rossmann螺旋α1同轴。
e) Nox的原始视图与CATH叠加模型对齐，Nox骨架轨迹以红色突出显示。Rossmann螺旋α1上的替换I159T用红球标记。α1轴用黄色线突出显示。
f) Bdh的最小Rossmann基序（PDB 1GEG）标注了同轴螺旋轴和箭头，作为之前描述的设计位点的参考。
合成生物学相关内容讨论与合作，及文章免费投稿
欢迎联系我：shalafangjian
了解更多合成生物学内容，请关注 iSynFox 🦊: