作者：一只小羊
审核：peacestore
Xenium 是 10x Genomics 推出的一个用于空间转录组学的实验平台，能够捕捉单细胞层级的转录本表达信息，并且提供丰富的空间定位数据。下面将详细介绍 Xenium 下机数据的结构、常见的文件格式及其用途，以及如何使用不同工具（如 Xenium Explorer、Python 和 Seurat）进行数据读取和分析。
❐ Xenium 数据下机后的文件 ❐
做xenium分析，我们从公司拿到手的就是以下格式的文件。不过随着版本迭代，文件内容有些许改变。以下是针对xenium ranger (XR) v3.0~v3.1，Xenium Onboard Analysis (XOA) v3.0~v3.3之间的数据。
2025年8月，XOA系统更新为4.0版本，9月XR也同步更新到4.0
结果的部分内容有所改动，同时单通道荧光图命名也有些许改变，不影响后续分析，但是在使用xenium explorer的时候需要使用v4.0（我们下一篇推送会详细讲解xenium explorer的使用）：
此外，自从2024年6月之后，为了优化读取速度，transcripts.csv.gz就不再出现于结果目录中了，因此导致结果中cells和transcripts的结果文件不太对称。
（1）使用xenium explorer查看数据
使用xenium explorer，至少需要的文件包括：
○ experiment.xenium：作为索引，加载以下对应文件
○ transcripts.zarr.zip：转录本的位置信息
○ cells.zarr.zip：细胞信息的汇总文件，包括细胞/细胞核分割掩码/边界
○ cell_feature_matrix.zarr.zip：用于提供每个细胞中每个基因的计数结果，在圈选区域查看每个细胞中基因表达情况时发挥作用。
○ analysis.zarr.zip：用于提供细胞的分群信息
○ morphology_focus：提供每个荧光通道的图片信息
○ analysis_summary.html：xenium explorer中的菜单栏有设置此信息的加载，所以需要此文件
在10x官网下载数据时，有的就会提供这样一个简单版本的数据以供查看：
（2）使用python对xenium数据进行后续分析
python包spatialdata_io可以读取xenium下机文件，具体使用的文件为：
○ experiment.xenium：用于提供重要的版本信息、像素大小等
○ nucleus_boundaries.parquet：提供细胞核的边界信息
○ cell_boundaries.parquet：提供细胞的边界信息
○ transcripts.parquet：提供转录本位置信息
○ cells.parquet：提供cell metadata中的z_level和nucleus_count
○ cells.zarr.zip：用于提供cell metadata信息
○ cell_feature_matrix.h5：表达矩阵
○ morphology_focus：荧光图像
以上信息读取之后得到的数据为sdata，格式如下：
其中table就是表达矩阵，取出来可以看到以下信息：
分析代码：
import scanpy as sc
from spatialdata_io import xeniumsdata = xenium(xenium_path)# xenium_path就是前面展示的目录结构的地址adata = sdata.tables["table"]sc.pp.filter_cells(adata, min_counts=10)sc.pp.filter_genes(adata, min_cells=5)adata.layers["counts"] = adata.X.copy()sc.pp.normalize_total(adata, inplace=True)sc.pp.log1p(adata)sc.pp.pca(adata)sc.pp.neighbors(adata)sc.tl.umap(adata)sc.tl.leiden(adata)
（3）使用R对xenium数据进行后续分析
R包seurat中的LoadXenium函数可以读取xenium数据，需要的信息基本和spatialdata_io中的函数一致，不过读取的文件是h5/parquet/csv.gz，优先读取parquet，如果没有则读取csv.gz格式的文件，最大的区别是不会读取图片信息。
需要注意的是，seurat从v5.2.0开始才针对下机文件中没有transcripts.csv.gz进行了修改。所以如果seurat版本较早，那么会出现读取问题，报错没有此文件。
分析代码：
library(Seurat)
options(future.globals.maxSize = 10 * 1024^3) # 设置内存限制为 10 GB，如果不够需要再调大
# Load the Xenium data
xenium.obj <- LoadXenium(path, fov = "fov", segmentations = "cell")
# remove cells with 0 counts
xenium.obj <- subset(xenium.obj, subset = nCount_Xenium > 0)
xenium.obj <- SCTransform(xenium.obj, assay = "Xenium")
xenium.obj <- RunPCA(xenium.obj, npcs = 30, features = rownames(xenium.obj))
xenium.obj <- RunUMAP(xenium.obj, dims = 1:30)
xenium.obj <- FindNeighbors(xenium.obj, reduction = "pca", dims = 1:30)
xenium.obj <- FindClusters(xenium.obj, resolution = 0.3)
Xenium 下机数据每种格式文件用途汇总
✧ Zarr 格式：主要用于 Xenium Explorer 中的数据加载。Zarr 格式数据具有分块存储和读取、高效压缩、并行访问的特点，适用于存储大规模高维数据，如转录本的位置信息、细胞信息、分析结果和图像数据等。Zarr 文件结构类似于一个层级化的目录系统（类似于 HDF5），每个目录下可以存储不同的数组数据，文件内部的组织结构非常灵活。
✧ Parquet 格式：用于 Python 和 R 读取分析。Parquet 格式适用于结构化数据，如细胞元数据、转录本的位置信息和基因表达矩阵等。相比 Zarr 格式，Parquet 格式更适合进行快速的列式查询。
✧ CSV.gz 格式：相当于是一个parquet数据的备份。
❐ 对下机文件重新分析 ❐
如果说对于xenium的分割结果不满意，xenium ranger提供了重新分析的选项：
（1）调整分割参数，重新分割并生成结果文件（比如当有很多转录本在细胞外面时，可以选择增加expansion-distance，使得细胞更大，纳入更多的转录本）；
（2）导入从QuPath、cellpose、baysor等重新分割后的mask掩码（格式为GeoJSON/tif/npy/json），生成对应的结果文件
其中重新分割resegment在v4.0之后增加了分割大细胞的选项：
官方数据展示效果很不错（下图），如果大家的数据中有这种大细胞，可以尝试优化分割效果：
❐ 基因panel ❐
gene_panel.json这里面描述了panel中的所有基因、panel的信息，大多数基因都设计了2-3个探针。例如：
人的panel是5001个基因，小鼠的panel是5006个基因。两者的panel中的基因差别还是蛮大的。
panel中基因的具体信息如下，其中一多半的基因标注了细胞类型，可以考虑作为细胞注释的参考：
❐ 结语 ❐
从本期开始，我们开启了xenium的空间转录组分析专题，初步内容包括：数据格式介绍、xenium explorer使用、xenium数据的分析、多样本整合、细胞注释、空间邻域分析、空间邻近度分析等，有丰富的代码和结果展示，带大家从入门到精通！
下一期介绍xenium explorer使用~
❐ 参考 ❐
【1】xenium下机数据官网详细说明：https://www.10xgenomics.com/cn/support/software/xenium-onboard-analysis/latest/analysis/xoa-output-understanding-outputs
【2】xenium 5kg enepanel的基因说明：
https://www.10xgenomics.com/support/software/xenium-panel-designer/latest/tutorials/pre-designed-xenium-prime-5k
【3】seurat官网中xenium数据的分析教程：
https://satijalab.org/seurat/articles/seurat5_spatial_vignette_2#mouse-brain-10x-genomics-xenium-in-situ
【4】squidpy官网中xenium数据的分析教程：
https://squidpy.readthedocs.io/en/stable/notebooks/tutorials/tutorial_xenium.html
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