作者：三金
审核：一只小羊、peacestore
前面介绍了如何使用Seurat对Xenium数据进行整合分群，今天介绍一种基于 Python 生态，以无监督的批次平衡近邻图构建为核心，可以对Xenium 等百万级细胞的大规模空间数据进行整合分群的方法：BBKNN。
2021年发表在Genome Biology上的一篇文章(A comparison of batch effect correction methods for single-cell RNA sequencing data)中提到，BBKNN在“速度 + 大数据集 + 生物学保留” 维度最优，Harmony 在“中等数据集 + 整合效果”最优，cca 在“小数据集 + 精细分群”最优。
利用 UMAP 可视化对小鼠细胞图谱数据集 2 的 14 种批次效应校正方法进行定性评估
从按批次着色 的 UMAP 图能看到，BBKNN 处理后，不同批次的细胞没有出现明显的抱团分离现象，而是均匀散落在整个图谱中。在按细胞类型着色的UMAP图中，相同类型的细胞聚集紧密，不同类型之间的边界清晰可辨，在去除技术噪音的同时，牢牢保留了细胞固有的生物学异质性。
各方法在不同数据集的运行时间
BBKNN 的运行时间与 Harmony 接近，在部分数据集上甚至更短，且显著快于 Seurat 3、fastMNN 等方法。
>准备样本数据和样本信息文件sample_info.txt，oldsample是前面的两个数据文件（默认样本名称），sample列是新样本名称，group列对应组别信息
cat sample_info.txtoldsample sample groupXenium_Prime_Human_Ovary_FF_outs S1 SXenium_Prime_Ovarian_Cancer_FFPE_XRrun_outs S2 T
>准备分析环境:安装需要的python库，如果是conda环境也可以使用conda快速安装。
pip install pandas scanpy bbknnpip install spatialdatapip install spatialdata_io
>导入整合分群所需要的python库
#导入python库
import pandas as pd
import scanpy as sc
import bbknn
import spatialdata as sd
from spatialdata_io import xenium
import matplotlib.pyplot as plt
#读取样本信息文件
sample_info = pd.read_csv("./sample_info.txt", sep='\t')
>读取并合并所有样本数据，使用spatialdata_io库中的xenium函数加载Xenium数据
adatas = []
for _, row in sample_info.iterrows(): oldsample = row['oldsample'] sample = row['sample'] group = row['group'] sdata = xenium(oldsample) adata = sdata['table'] adata.obs['sample'] = sample adata.obs['group'] = group adata.obs['oldsample'] = oldsample adatas.append(adata)combined_adata = adatas[0].concatenate(adatas[1:], index_unique='-')
>这里需要提一下xenium()函数load后的样本数据结构，后续如果是单样本分析无需整合，直接使用该函数load样本数据即可。
Images（图像数据）：存储组织 / 细胞的形态学成像数据（如明场、荧光染色图像），是空间分析的 “背景图层”
Labels（分割标签）：存储细胞 / 细胞核的像素级分割掩码。cell_labels：细胞级分割掩码，每个像素对应一个细胞 ID，nucleus_labels：细胞核级分割掩码，每个像素对应一个细胞核 ID
Points（点数据）：每个点代表一个转录本分子的空间坐标（x/y/z）
Tables（表格数据）：每个细胞的转录组数据 + 空间属性
>数据预处理：主要包括细胞过滤>基因水平过滤>表达量归一化>对数转换>高变基因筛选步骤，筛选后的高变基因集将用于后续 PCA 降维、批次效应校正及聚类分析。
sc.pp.filter_cells(combined_adata, min_genes=10)
sc.pp.filter_genes(combined_adata, min_cells=3)filtered_cell_ids = combined_adata.obs.indexsc.pp.normalize_total(combined_adata, target_sum=1e4)sc.pp.log1p(combined_adata)#高变基因的选择跟进自己的需求#Xenium平台可以使用全部基因sc.pp.highly_variable_genes( combined_adata, min_mean=0.0125, max_mean=3, min_disp=0.5, n_top_genes=5000 )
>对预处理后的数据开展降维、批次校正及聚类分析：首先基于筛选出的高变基因集进行主成分分析（PCA）；随后使用 BBKNN 算法校正样本批次效应（以 “sample” 为批次分组依据，根据自己数据批次调整），消除不同样本间的技术偏差；接着通过 Leiden 算法对细胞进行无监督聚类，确定细胞亚群分类；最后基于校正后的近邻关系进行 UMAP 降维。
sc.tl.pca(combined_adata, svd_solver='arpack', n_comps=30)
sc.pl.pca_variance_ratio(combined_adata, n_pcs=30, show=False)
plt.savefig("pca_variance_ratio.png",dpi=300, bbox_inches="tight")
bbknn.bbknn(combined_adata,batch_key="sample",n_pcs=30)
sc.tl.leiden(combined_adata, resolution=0.6)
sc.tl.umap(combined_adata, n_components=2)
sc.pl.umap(combined_adata, color=['leiden'], show=False)
分群效果
需说明的是，分群效果与样本所属的组织类型关联度较高，实际应用中应根据项目的样本背景、研究目的等选择贴合需求的分析方法
这里用到的两个样本总计大约160万细胞，具体运行时间和资源消耗：
Python 下的 BBKNN 批次校正方法，填补了 Seurat 在大样本、高细胞量Xenium 数据处理中的资源适配短板。同时BBKNN 在速度、大数据兼容性及生物学特征保留上的显著优势，使其成为大规模 Xenium 数据整合的优选工具。大家可以在分析中结合自己的项目灵活调整分析策略，高效完成 Xenium 数据的批次校正与细胞亚群挖掘。
[1]Tran HTN, Ang KS, Chevrier M, Zhang X, Lee NYS, Goh M, Chen J. A benchmark of batch-effect correction methods for single-cell RNA sequencing data. Genome Biol. 2020 Jan 16;21(1):12. doi: 10.1186/s13059-019-1850-9. PMID: 31948481; PMCID: PMC6964114.
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