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【方案参考】CRISPR／CAS 系统介导的基因组大片段 DNA 编辑

木木西里

2020-08-20

导读：摘要随着测序技术以及大数据信息科学的发展，越来越多导致疾病的基因突变己经被发现。

摘要

随着测序技术以及大数据信息科学的发展，越来越多导致疾病的基因突变己经被发现。

不仅如此，如今的技术己经可以预测一些疾病的发生可能与基因组上哪些ＤＮＡ突变相关。

然而，需要验证预测的结果，或是对己经发生的基因突变进行治疗，就必须依靠基因编辑技术。传统的基因改造技术以基因打勒或是化学诱变（如乙院亚确基脲）为主。前者依赖于胚胎干细胞自发性同源重组反应，而后者通过诱导随机性的突变进而再筛选出需要的突变。

两者都需要投入相当的时间和精力，况且有些物种还没有完整的胚胎干细胞培养体系，难以在日常的研宄中广泛使用。

由于ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统祀向新的ＩＥ点只需要合成新的ＳｇＲＮＡ，相较于之前的技术更为灵活，且操作简便，效率更高，所以很快在基因编辑领域发展开来。

简述

方案包含4大流程：

1、体外表达重组Ｃａｓ９蛋白以及活性检测。

2、利用Ｃａｓ９蛋白构建带有点突变的小鼠。

3、利用重组Ｃａｓ９蛋白敲除基因组中长片段ＤＮＡ。

4、Ｇａｓ９蛋白介导的长片段ＤＮＡ的整合及功能的鉴定。

核心设备

蛋白纯化仪、酶标仪、超微量分光光度计、荧光定量PCR、超声波细胞破碎仪、显微操作系统、体式显微镜、PCR仪、石蜡包埋机、石蜡切片机、冷冻切片机

关键词

CRISPR／CAS、Ｃas９，ｓｇＲＮＡ、同源重组、基因编辑、敲除

实验流程及设备

相关科研团队

从事此研究方向比较强的科研团队

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基本概念

基因编辑，表达载体构建，转基因小鼠，免疫反应，荧光蛋白表达

实验流程

1、体外表达重组Cas9蛋白以及活性检测

1.1 Cas9体外表达载体的构建

根据ｐｘ３３０载体中Ｃａｓ９设计引物，以px330菌株为模板，PCR仪扩增目的基因，琼脂糖凝胶进行跑胶，纯化回收目的片段，目标片段与表达载体连接，转入受体大肠杆菌细胞。

1.2 原核Ｃａｓ９蛋白的诱导表达和纯化

转化菌株扩大培养，OD 值在0.8-1之间加入IPTG诱导培养17-20h，诱导菌株离心去上清，重悬后用超声波破碎仪提取蛋白，离心收集破碎菌液，将上清液通过结合柱，利用蛋白纯化仪纯化Cas9 蛋白。

1.3 ｓｇＲＮＡ的合成

利用两步ＰＣＲ的方法合成ＣＮＮＤ１基因片段的ｓｇＲＮＡ（ｓｇＣＮＮＤｌ）。第一步ＰＣＲ合成ＳｇＲＮＡ的尾部骨架。第二步ＰＣＲ扩增ｓｇＣＮＮＤ１，ｄｎａ－ｓｇＣＮＮＤｌ进行体外转录，所得ＲＮＡ即为ｓｇＣＮＮＤｌ。通过琼脂糖凝胶电泳检测ｓｇＣＮＮＤｌ转录质量。

2、利用Ｇａｓ９蛋白构建带有点突变的小鼠

2.1 构建Ｓｉｎｌ以及Ｆ９的ｓｇＲＮＡ

设计革Ｅ向Ｓｉｎｌ第２号外显子与Ｆ９第８号外显子的ｓｇＲＮＡ记为：ｓｇＳｉｎｌ，与ｓｇＦ９。在设计得到的序列５’加上Ｔ７启动子序列，３’加上ＳｇＲＮＡ骨架。PCR仪扩增目的基因，琼脂糖凝胶进行跑胶，纯化回收目的片段，目标片段与表达载体连接，转入受体大肠杆菌细胞。

2.2 单细胞期小鼠胚胎的准备

激素处理过的母鼠与约１０周龄公鼠交配，另取约２０只母鼠与切除输精管的公鼠交配（每笼交配一对），以得到假孕母鼠。将有交配栓的假孕母鼠取出饲养在单独的笼内作为胚胎移植的受体。母鼠通过上述激素处理后，用Ｃ０２窒息法处死，打开腹腔轻轻切断并取下输卵管，在体视显微镜下用医用钳轻轻剖开输卵管的壶腹部让胚胎流出输卵管。取出卵丘细胞后，在３７°Ｃ，５％Ｃ０２的培养箱内培养胚胎准备注射。

2.3 制备显微注射用重组Ｈｉｓ６－Ｃａｓ９蛋白，ｓｇＲＮＡ，ｓｓＯＤＮ混合物

在冰上融化Ｈｉｓ６－Ｃａｓ９蛋白、ｓｇＳｉｎｌ、ｓｇＦ９以及ｓｓＯＤＮ。在３０uＬ体系中加入Ｈｉｓ６－Ｃａｓ９蛋白、３０ｎｇ／uＬｓｇＳｉｎＩ或ｓｇＦ９，以及１ｓｓＯＤＮ。３０uＬ体系为单次注射用量。将上述混合物在４°Ｃ以１２０００ｒｐｍ离心10min以去除微小颗粒，吸取上清静置在冰上备用。

2.4 单细胞小鼠胚胎显微注射和移植

利用显微注射管调节胚胎位置使其原核子在胚胎的中央，并在Ｘ轴上距离胚胎固定吸管最远。调整胚胎至最佳位置之后，加强负压充分固定胚胎。重新对焦原核以及显微注射吸管。将吸管的尖端依次推入透明带，细胞膜，原核膜；此时应能立刻看到原核缓慢膨胀。

将注射完的胚胎转移至其余的Ｍ２液滴中。继续重复注射下一个胚胎注射。用细慑轻轻剖开卵巢囊，找到漏斗管，将准备好的胚胎移植管插入卵巢开口中，缓慢注入胚胎，直到气泡全部进入输卵管的壶腹，静置几秒钟后，慢慢取出胚胎移植管。松幵脂肪垫，将小鼠生殖器官放回体内，缝合肌肉用伤口夹闭合皮肤伤口。

将移植完毕的小鼠放置在加温塾上直到其苏醒，待小鼠完全清醒后将其放回饲养笼中。一般母鼠会在３周产下Ｆ０代小鼠。

2.5 Ｆ１代小鼠的基因型鉴定

繁殖出F1代小鼠后，用手术剪取小鼠尾端一小段组织，提取小鼠全基因组DNA,利用紫外－可见光分光光度计测取基因组ＤＮＡ的浓度, 利用特异性引物进行，PCR反应，对反应结果进行凝胶电泳分析，初步判断扩增产物，在对扩增产物进行测序分析。

3、利用重组Ｃａｓ９蛋白敲除基因组中长片段ＤＮＡ

3.1 组织脱水透明

取大鼠肝脏肝脏组织，依次浸泡在５０％－７５％－８５％－９５％－１００％的乙醇溶液中脱水。每个梯度的脱水时间为1ｈ。在１：１的乙醇：二甲苯溶液中浸泡1ｈ，取出肝脏组织块浸泡入二甲苯溶液中持续1ｈ。

3.2 组织包埋与切片

将透明后的肝脏组织块从二甲苯中取出浸入６５°Ｃ石蜡溶液中０．５ｈ。取出肝脏组织块，浸入新配置的石錯溶液中持续３ｈ，按照徕卡组织包埋、切片机操作说明对肝脏组织块进行石蜡包埋，切片。将切片在烘片机上３７°Ｃ供烤２0min后调高温度至６０°Ｃ烘烤２ｈ收起组织切片。

3.3 免疫组化

将准备好的肝脏切片，漂洗、去过氧化氢酶后，用山羊血清封闭30min，吸干封闭液，加入抗１：５００稀释的Fah抗体在４°Ｃ湿盒中孵育过夜。吸干Fah抗体，洗涤过后加入二抗，孵育30分钟后加入染色液在显微镜下观察。

4、Ｃａｓ９蛋白介导的长片段ＤＮＡ的整合及功能的鉴定

4.1 大鼠小肠组织冰冻切片

取４周龄大鼠，运用ＣO２窒息处死，剖开大叔腹腔，找到肠组织，用手术裡分离肠系膜取出整个肠组织，将小肠组织在１５％鹿糖水中脱水３ｈ，换入３０％鹿糖水脱水３ｈ，换入50％鹿糖水脱水８ｈ，取出脱水后的小肠组织，进行包埋、切片。

4.2 大鼠小肠组织免疫荧光

将冰冻切片的大鼠小肠切片漂洗，在将切片浸入0.1％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００打孔10min，继续漂洗两次，用２％ＢＳＡ封闭组织３０min。吸干ＢＳＡ，漂洗一次，在组织上滴加1：500稀释的鼠源抗ＧＦＰ抗体。将切片放入湿盒中，４℃中孵育８ｈ以上，吸干ＧＦＰ抗体，漂洗３次每次５min，滴加山羊抗鼠荧光二抗在室温孵育1ｈ，在荧光显微镜下观察。

4.3 小鼠ＬａｃＺ染色

实验４８小时前，小鼠腹腔注射 Tamoxifen，以ＣＯ２窒息法处死小鼠，副去刺毛，取皮肤组织，漂洗干净后，用预冷的LacZ固定液漂洗两次,，之后在４℃固定液中固定２ｈ。将皮肤自组织以室温染色过夜，漂洗干净后，把组织进行包埋、切片、脱水、染色后，在显微镜下观察。

4.4 大鼠小肠总ＲＮＡ提取

取一段大鼠小肠组织，利用电动匀浆机将小肠组织打磨，转移上清至一个新的干净５ml离心管中，经过裂解、吸附、分离纯化后，得到小鼠小肠总RNA，保存于-80℃冰箱中。

5、ELISA检测方法

通过已有的特异性单克隆抗体，建立ELISA检测方法来检测样品中是否含有待测抗原

5.1 建立间接竞争ELISA

通过标记抗体，包被抗原，固相抗原和液相抗原（样品）竞争标记抗体，以此来通过结果显色来侧重反映检测样品中的抗原存在量。仪器同2.2

5.2 ELISA检测方法优化

通过优化ELISA反应体系中pH变化影响、缓冲液、温度、反应时长等几方面优化出最佳反应条件。仪器同2.2

6、胶体金免疫层析试纸的制备

胶体金是指氯金酸在抗坏血酸等还原剂的作用下聚集为一定粒径的金纳米颗粒，在静电力的作用下，形成带负电的稳定的疏水胶体溶液。