抗原是能够诱发免疫反应（免疫原性），并与由此产生的抗体发生特异性反应（反应原性）的物质。
抗原的分子量越大，结构越复杂，免疫原性则越强。重金属离子原子量一般小于1000Dal，不能刺激机体发生免疫应答反应，又因为能够不可逆的改变蛋白质的结构，所以需要通过双功能螯合剂连接载体蛋白与重金属离子来合成完全抗原。
单克隆抗体制备的首要步骤就是完全抗原的成功合成。ITCBE 既有 EDTA 可以螯合大多数的金属离子的性质，又具有异硫氰根（-SCN），可以与蛋白上的羧基（-COOH）反应。因此可利用 ITCBE连接载体蛋白与铅离子，制备铅完全抗原。
以此免疫小鼠可制得相对应的抗重金属铅的单克隆抗体。
简述：
方案包含完全抗原制备、筛选细胞株、单克隆抗体制备、间接ELISA检测方法建立等4大部分6个流程，涉及18种设备。
核心设备：
酶标仪、恒温培养箱、二氧化碳培养箱、超净工作台、倒置光学显微镜
关键词：
单克隆抗体、间接竞争酶联免疫检测法、胶体金免疫层析试纸
01
实验及流程简述
说明：
核心内容一为必须整理的内容，对于整个工艺的每一步都有流程介绍，内容无需详细，但步骤一定要完整。
（一）实验流程及设备
（二）相关科研团队
从事此研究方向比较强的科研团队（提供3个）：
相关硕士博士毕业论文（提供3篇）：
02
实验概念及详细流程
说明：
1、基本概念，只需要提供名称即可，不需要提供说明；
2、实验流程，对模块一中的“实验流程及设备”详细描述，请准确标注“编号”。
（一）基本概念
重金属、螯合剂、单克隆抗体、间接竞争酶联免疫检测法、胶体金免疫层析试纸、
（二）实验流程
1、人工完全抗原制备
利用双功能螯合剂EDTA、ITCBE等在最适pH条件下分别螯合铅离子（铅标准溶液）和载体蛋白。
1.1 免疫原制备
利用双功能螯合剂Isothiocyanobenzyl-EDTA（ITCBE）分别螯合铅离子和载体蛋白KLH（钥孔血蓝蛋白）作为免疫原。称量需要电子分析天平，混合后基于恒温震荡培养箱震荡反应48h.
1.2 包被原制备
利用双功能螯合剂Isothiocyanobenzyl-EDTA（ITCBE）分别螯合铅离子和载体蛋白BSA（牛血清白蛋白）作为检测原。称量需要电子分析天平，混合后基于恒温震荡培养箱震荡反应48h.
1.3 完全抗原表征
人工合成的完成抗原需要进行鉴定表征，可通过紫外分光光度计测得完全抗原的波峰偏移或者根据分子量差异进行凝胶电泳（核酸电泳仪）来判断是否合成成功。
2、小鼠免疫
用人工合成免疫原通过皮下背部注射和腹腔注射结合的方法免疫Balb/c小鼠，获得具有高效价的小鼠。
2.1 效价检测
取小鼠尾血进行效价检测，尾血需放置37℃水浴锅半小时，后离心（高速冷冻离心机）取上清检测。方法为酶联免疫检测法。
它的原理是将抗原或者抗体吸附在一种固相载体上，与待测的抗体或抗原结合，再与酶标抗原（抗体）反应，最后借助酶的底物发生催化反应，使底物显色。在实际检测过程中，主要分为间接竞争酶联免疫法和直接竞争酶联免疫法。
过程中需要用到移液枪，洗板推荐用排枪手洗，量大的话可使用洗板机器。整个过程在恒温培养箱里反应，显色结果需要用酶标仪进行OD值检测显示。
2.2 间接竞争ELISA
通过间接竞争ELISA检测有效价的小鼠尾血并找出有竞争的免疫小鼠，说明该小鼠体内大部分稳定分泌所免疫抗原的特异性抗体。
过程中需要用到移液枪，洗板推荐用排枪手洗，量大的话可使用洗板机器。整个过程在恒温培养箱里反应，显色结果需要用酶标仪进行OD值检测显示。
3、细胞融合
目标小鼠抗血清达到一定效价后取出脾脏研磨得到脾细胞。将脾细胞与骨髓瘤细胞按一定比例混合，一般为3:1-5:1，用融合剂PEG2000促进融合。
3.1 细胞融合准备
细胞融合前需复苏骨髓瘤细胞至细胞生长布满约80%培养皿即可分板待用。
还需准备小鼠腹腔细胞作为饲养细胞，过程需在超净工作台进行，通过倒置显微镜观察细胞生长情况，在5%浓度37℃的二氧化碳培养箱中培养细胞。
3.2 筛选杂交瘤细胞并克隆化
用HAT选择培养液筛选杂交瘤细胞，细胞融合后约7-10天通过显微镜观察细胞集落生长情况，并对目标集落上清进行ELISA检查初筛出有效价目标孔，再通过间接竞争ELISA找出单克隆抗体孔并及时进行亚克隆（此处由于筛选细胞量大所以ELISA过程使用洗板机洗板）。
过程需在超净工作台进行，通过倒置显微镜观察细胞生长情况，在5%浓度37℃的二氧化碳培养箱中培养细胞。筛选出来的细胞株还需进行染色体分析是否为杂交瘤细胞，染色体染色后需在1000倍下显微镜观察拍照。
4、腹水制备
通过致敏小鼠并打入目标细胞株的方法制取腹水。
4.1 单克隆抗体亚型鉴定
通过亚型试剂盒可鉴定单克隆抗体亚型，原理同酶联免疫检测法。仪器同2.2
4.2 单克隆抗体的大量制备与纯化
将筛选到的单克隆细胞株注射入小鼠腹腔，产生大量腹水后收集含单克隆抗体的腹水，然后纯化抗体。一般用ProteinG法纯化IgG亚型抗体。
5、ELISA检测方法
通过已有的特异性单克隆抗体，建立ELISA检测方法来检测样品中是否含有待测抗原
5.1 建立间接竞争ELISA
通过标记抗体，包被抗原，固相抗原和液相抗原（样品）竞争标记抗体，以此来通过结果显色来侧重反映检测样品中的抗原存在量。仪器同2.2
5.2 ELISA检测方法优化
通过优化ELISA反应体系中pH变化影响、缓冲液、温度、反应时长等几方面优化出最佳反应条件。仪器同2.2
6、胶体金免疫层析试纸的制备
胶体金是指氯金酸在抗坏血酸等还原剂的作用下聚集为一定粒径的金纳米颗粒，在静电力的作用下，形成带负电的稳定的疏水胶体溶液。
在抗体或抗原上标记胶体金，通过检测标记物来反映被检抗原或抗体的存在量的技术，称为胶体金免疫技术，被广泛的用于快速检测方法中。目前应用最广泛的是胶体金免疫层析法。
可基于制备的重金属单克隆抗体，建立了可用于检测水样、血清和牛奶样品中重金属的胶体金免疫层析试纸条技术。
6.1 免疫胶体金标记
烧制好的胶体金需要用分光光度计扫描400nm~600 nm 下的吸收峰,烧制时需要用到磁力搅拌仪搅拌，然后通过确定胶体金标记最适蛋白量和胶体金标记最适pH 值进行抗体标记
6.2 免疫胶体金检测卡的制备
依据实验中的最优的标记蛋白浓度和山羊抗小鼠IgG 浓度在划线喷金系统上把抗原和二抗划线于NC 膜上。
然后把划线的NC 膜放置于37℃恒温培养箱干燥10 min，同时每个金标垫加入最佳金标抗体使用量的金标抗体于37℃恒温培养箱干燥10 min。
再用数控裁条机裁条，用0.01 M PBS 把10 种不同的完全抗原（待测样品）稀释至最佳浓度。
然后向组装好的金标检测卡样品垫中依次加入100 μL 稀释好的不同抗原，即可观察反应结果。
03
核心参数
说明：
会涵盖模块一中提及的所有设备。
“在用品牌型号”指的是您在用、用过的设备。“设备名称”“核心参数”为必填项；“一般性要求”“配套设备”非必填。但是，完整程度影响方案设备选型的确定。
买耗材仪器，找木木西里：www.mumuxili.com
资源 | 超全雅思托福备考攻略，免费领！
资源 | SCI绝密实验资源一锅端~方案、神器、软件、教程应有尽有！
点击文末阅读原文，更多精彩等你来看！